Целью данной процедуры является оценка организации и динамики микротрубочек in vivo. Нейроны представляют собой поляризованные клетки с отчетливыми аксональными, дендритными и синаптическими компартментами, поддерживаемыми их основным цитоскелетом. Микротрубочки образуют большую часть нейронального цитоскелета, а динамика и ориентация определяют ключевые события во время развития и созревания нейронов.
Микротрубочки состоят из гетеродимеров альфа- и бета-тубулина и по своей природе поляризованы с высокодинамичными плюс-концами и стабильными минус-концами. Во время полимеризации на плюс-концах, многомолекулярный комплекс концевых связывающих белков, временно связывается с протофиламентами и способствует сборке тубулиновых димеров. Эта методика поможет нам визуализировать нейронные микротрубочки in vivo.
С помощью этой методики можно определить ориентацию и другие параметры динамических микротрубочек при развитии и регенерации нейрона C.elegans. Мы обычно используем этот репортер для визуализации динамики микротрубочек в сенсорных нейронах. Тем не менее, можно экспрессировать этот репортер в других типах клеток, таких как мышцы и кожа, чтобы визуализировать динамические микротрубочки в этих клетках.
Флуоресцентно меченые концевы связующие белки, такие как EBP к GFP здесь, выглядят как кометы. Динамика этих комет коррелирует с сопутствующим ростом микротрубочек и является ключевым показателем для измерения динамики и ориентации микротрубочек. Для того чтобы наблюдать эти кометы в определенном типе клеток, трансгены с ДНК EBP-2 и GFP экспрессируются под определенным промотором.
Для экспрессии в нейронах PLM этот трансген экспрессируется под make for promoter. Эти трансгенные черви можно просматривать под стереомикроскопом, с флуоресценцией, установленной перед сортировкой или монтажом. Для установки червей для визуализации комет EBP мы делаем 10% Argos в буфере M9.
и поместите каплю на стеклянную горку. Другой слайд используется для вдавливания капли в пленку, которая затвердеет в подушечку. В качестве монтажной среды мы используем 0,1 мкм, полистирольные шарики, несколько червей собирают и повторно суспендируем в бисерном растворе.
Крышка браконьера, чтобы обездвижить червей и взята для визуализации. Установленные могут быть изображены на любом флуоресцентном микроскопе с камерой для получения изображений высокого разрешения. Установка оснащена вращающимся дисковым блоком для более быстрого сбора и снижения фотоотбеливания и фототоксичности.
Слайд удерживается на сцене, а поле червей фокусируется и центрируется с помощью ярко-полевого освещения. Для этой цели можно использовать объектив с низким увеличением, такой как 5X или 10X. Черви могут быть перефокусированы при высоком увеличении цели, такой как 63X, используя ту же подсветку.
Эта цель обеспечивает оптимальное пространственное разрешение для визуализации комет. Фиксированное центрирование PLM-нейрона выполняется под флуоресцентной подсветкой, чтобы предотвратить чрезмерное воздействие света и фотоотбеливание прума. Для получения изображений мы используем программное обеспечение для отправки с сайтов.
Используя конфигурацию изображения в реальном времени в канале brightfield, мы фокусируем хвостовую область червя и центрируем ее в поле зрения. За этим следует фокусировка нейрона PNM с использованием конфигурации световой визуализации с 488-нанометровым светом возбуждения. Для покадрового захвата создается экспериментальная установка, где время экспозиции, продолжительность таймлапса и интервал между кадрами определяют временные навыки визуализации.
Для количественных измерений некоторые фильмы комет EBP должны быть проанализированы на Image J, который является программным обеспечением с открытым исходным кодом. Полученная временная съемка открывается как многообразная нить, которую можно предварительно просмотреть как фильм. В этом конкретном промежутке времени кометы можно увидеть в теле клетки, переднем и заднем отроще нейрона PLM.
Кометы, отошедших от тела клетки, классифицируются как плюс-конец, а те, которые движутся к телу клетки, классифицируются как минус-конец. Для начала анализа проводится сегментированная линия над интересуемой областью, которая в данном случае является внутренним процессом PLM-нейрона. Этот отрезок линии преобразуется в кимограф с помощью функции реликтов изображений.
Кимограф представляет собой изображение времени расстояния с диагональными складками, представляющими движущиеся кометы. На этих трассах можно нарисовать прямые сегменты, а параметры измерения можно задать с помощью меню анализа. Эти параметры могут быть преобразованы в стандартные измеримые величины и единицы измерения в программе анализа данных, такой как Excel.
Ширина следа соответствует длине роста. Высокая часть представляет продолжительность роста, а угол складки дает направление комет. Эти кометы могут быть дополнительно классифицированы на плюс-конец и минус-конец, чтобы найти относительную ориентацию микротрубочек.
Трансгенная экспрессия EBTA GFP может быть адаптирована для наблюдения динамики микротрубочек в различных клеточных контекстах, таких как новая регенерация. Чтобы наблюдать динамику микротрубочек в области рейтинговых аксонов, аксон травмируется с помощью фемтосекундного лазера, который может точно разорвать аксон, не вызывая массивного побочного ущерба. После травмы черви могут быть восстановлены на засеянных пластинах двигателя для последующих наблюдений.
Нейроны PLM демонстрируют надежную регенерацию экзонеров, которую можно наблюдать уже через шесть часов после травмы. Чтобы предотвратить фототоксичность к регенерации новых прав, живая визуализация проводится в вращающемся дисковом микроскопе. Покадровые приобретения регенерирующими аксонами впоследствии могут быть преобразованы в кимографы для анализа комет.
Продолжительность расстояния и направление комет могут быть интерпретированы с точки зрения ориентации и динамики микротрубочек. Моя критическая ориентация и динамика являются ключевыми определяющими факторами гражданских клеточных процессов, таких как деление клеток, миграция и поддержание клеточной архитектуры. Хотя существует множество инструментов, доступных для измерения динамики микротрубочек, измерение in vivo может быть сложным.
Автоцветульность, фототоксичность, артефакт экспрессии и переменные интенсивности , являются одними из трудностей, возникающих во время живого наблюдения за конечными связывающими белками для оценки динамики микротрубочек. Используя интегрированный трансген с низкой концентрацией депортированной ДНК и визуализацией с низкой освещенностью, это исследование рассмотрело методы смягчения некоторых из этих проблем. Модули визуализации и анализа, описанные здесь, могут быть расширены на другие репортеры на основе микротрубочек и транспорт белка.
Это применимо не только к нейронам C.elegance, но и может быть применено к другим типам клеток и модельным системам.
