Лекарственное сродство реагировать целевой стабильности, DARTS, является надежным методом для обнаружения новых малых молекул белка целей. Он может быть использован для проверки известных взаимодействий мало-молекулы белка и найти потенциальные цели белка для натуральных продуктов. В этом исследовании мы еще больше расширить возможности анализа данных эксперимента DARTS путем мониторинга изменений в стабильности белка и оценки сродства белково-лигандовых взаимодействий.
Белково-лигандовые взаимодействия могут быть построены против двух кривых, протеолитической кривой и кривой зависимости от дозы. Мы использовали взаимодействие mTOR-рапамицин в качестве образцового случая для создания нашего протокола. Выращивайте 293T-клетки с помощью DMEM с 10%фетальной сывороткой крупного рогатого скота, двухмилимолянным глутамином и 1%антибиотиками.
Инкубировать культуры при 37 градусах по Цельсию под 5%углекислого газа. Когда культура достигает 80 до 90% слияния, мыть клетки дважды с холодной PBS. Используйте сотовый скребок, чтобы собрать клетки в соответствующее количество холодного буфера лиза клетки и передать лизирование клеток в 1,5-миллиметровую трубку.
Инвертировать, чтобы смешать буфер лиза и лизирование клеток хорошо и инкубировать трубку на льду в течение 10 минут. Центрифуга трубки при 18 000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую 1,5-миллилитровую трубку и держите охлажденным на льду.
Выполните анализ BCA, чтобы приблизить концентрацию белка лисатов и рассчитать разбавление проназ на основе концентрации белка. Во-первых, перенесите лизат в две 1,5-миллилитровые трубки по 99 микролитров каждая. Добавьте один микролитер раствора мелкокаликулярного бульона к каждой алициту лизата и инкубировать две трубки в течение 30-60 минут при комнатной температуре при встряхивании.
На льду устанавливают серийные разбавления свежеоттая проназного раствора в 1x ТНК. После инкубации с небольшой молекулой, разделить каждый aliquot на 20 микролитров образцов в пяти трубках. Чтобы обеспечить одинаковое время пищеварения, через определенные промежутки времени каждые 30 секунд, добавьте два микролитера подготовленных проназных растворов в образцы соответственно.
Для одной контрольной группы добавьте два микролитера буфера ТНК. Через 5-20 минут, остановить переваривание шести труб через добавление двух микролитров холодного 20x ингибитора протеазы коктейль с 30-секундными интервалами. Хорошо перемешать и инкубировать на льду в течение 10 минут.
Разбавить каждый образец шестью микролитров 5x SDS-PAGE загрузки буфера и варить образцы в водяной бане при 70 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Теперь, для выполнения западной помарки, загрузите равное количество белка в скважины геля 8%SDS-PAGE, а также соответствующий молекулярный маркер веса. Запустите гель в течение 30 минут на 80 вольт, затем отрегулируйте напряжение до 120 вольт и продолжайте работать в течение одного-двух часов.
Убедитесь, что небольшая молекула может связываться непосредственно с потенциальными белками-мишенями. В этом протоколе инкубация с небольшой молекулой подтвердила защиту от протеолиза. Было установлено, что три группы защищены инкубацией рапамицином для управления транспортным средством.
Западные blotting проиллюстрировали при наличии белка mTOR при низких соотношениях проназ к белку и его уменьшение и потерю с увеличением соотношения. Протеолиз mTOR проназой был явно ингибируется наличием рапамицина и добавление рапамицина вызвало очевидный сдвиг в протеолитической кривой. Доза рапамицина зависит от повышения уровня mTOR, что свидетельствует о повышении устойчивости mTOR с лечением рапамицином.
Количественная оценка интенсивности целевой белковой полосы свидетельствует о том, что mTOR является целевым белком рапамицина. Для того, чтобы получить лучший эффект шаг за шагом, этот эксперимент, возможно, придется повторить несколько раз, чтобы получить подходящий диапазон проназа над соотношением белка.
