Анализ митохондриальной функции в индуцированных флуконазолом миниатюрных колониях Candida glabrata

Для начала поместите культуру Candida glabrata и среду YPD на рабочую платформу. Отрегулируйте оптическую плотность суспензии дрожжевых клеток на 600 нанометрах до 0,1 со средой YPD. Переложите один миллилитр клеточной суспензии в пятимиллилитровую пробирку.

Окуните стерильный ватный тампон в суспензию дрожжевых клеток. Проведите ватой взад и вперед по агаровой пластине Мюллера-Хинтона, дважды вращая на 60 градусов. Затем проведите тампон по периметру для равномерного покрытия.

Разделите пластину на три равных сектора с помощью маркера. Стерилизуйте щипцы над пламенем в течение одной-двух секунд. После охлаждения поместите по одному пустому диску в центр каждого сектора.

Добавьте по 12,5 микролитров бульона флуконазола в каждый диск. Тщательно перемешайте, чтобы избежать образования пузырьков, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20–24 часов. На следующий день добавьте 20 микролитров 20% трифенилтетразолия хлорида непосредственно в центр каждой колонии.

Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30–40 минут. Отсканируйте пластину с разрешением 1200 точек на дюйм с помощью 48-битного полноцветного оптического сканера. Лечение флуконазолом эффективно индуцирует миниатюрных мутантов C.glabrata.

Четкая круглая зона без роста окружала диск флуконазола в культуре T zero, что указывает на меньшую лекарственную устойчивость родительского гриба. В культуре Т-3 многие миниатюрные колонии образовались рядом с диском, что свидетельствует о лекарственной устойчивости после трех повторных сеансов фотодинамической терапии.