После инкубации семян арахиса, после инокуляции спор Aspergillus flavus, используйте щипцы для удаления кусочков семян из агара. Поместите кусочки семян в промаркированные семимиллилитровые флаконы, содержащие 13 керамических шариков циркония. Для экстракции фитоалексинов и афлатоксинов, в зависимости от размера семян, добавьте в пробирку два или четыре миллилитра водной смеси метанола и измельчите со скоростью 5,5 метров в секунду в течение 45 секунд.
Затем центрифугируйте при 1,860 х г в течение трех минут и соберите надосадочную жидкость в свежий флакон. Для анализа на афлатоксины с помощью стеклянного стержня, разрезанного под углом 90 градусов, в полипропиленовую колонку объемом 1,5 миллилитра вставить полиэтиленовую пористую фритту. С помощью изготовленной на заказ мерной ложки добавьте в колонку 50 миллиграммов силикагеля магния.
Закройте колонну идентичной фриттой и придавите ее вниз стеклянным стержнем. Добавьте 0,5 миллилитра надосадочной жидкости в специально упакованную мини-колонку и дайте экстракту стечь под действием силы тяжести в стеклянный флакон объемом четыре миллилитра. Добавьте в колонку один миллилитр водной смеси метанола, чтобы смыть примеси самотеком в тот же флакон.
После удаления комбинированных элюатов из флакона добавьте в колонку 1,2 миллилитра воды ацетона ацетилнитрила, 88% смеси муравьиной кислоты, чтобы разбавить фракцию афлатоксина в чистый стеклянный флакон. Испаряет растворитель из флакона в потоке азота в нагревательном блоке при температуре 45 градусов Цельсия. После выпаривания закупорьте флакон крышкой и охладите его в измельченных кубиках в течение одной минуты.
Поместите изготовленные на заказ фильтры-пипетки Пастера в одноразовые пробирки и положите их на лед, чтобы свести к минимуму испарение при фильтрации. Растворите сухой остаток в точной мере от 0,25 до 1,0 миллилитров метаноловой водной смеси. После вортекса переложите в фильтр аликвоту объемом 0,2 миллилитра.
Используйте газообразный азот для ускорения фильтрации во флакон автосамплера объемом 400 микролитров. Поместите флакон в автоподатчик UPLC и установите объем впрыска от 0,1 до 3,0 микролитров. Для получения фитоалексина переведите 200 микролитров надосадочной жидкости из семимиллилитрового флакона центрифуги в фильтр для пипетки Пастера.
После фильтрации наденьте на флакон соответствующий колпачок с политетрафторэтиленовой перегородкой. Для отделения афлатоксинов реализуйте градиент с использованием воды, метанола и ацетилнитрила с определенным процентным составом и временем выполнения. Установите скорость потока на 0,45 миллилитра в минуту и время работы на 9,5 минуты.
В системе подогревателя колонны установите температуру колонки на 40 градусов Цельсия. Чтобы количественно определить афлатоксины, установите длины волн возбуждения и излучения на 362 и 440 нанометров соответственно. Затем, используя метод калибровочной кривой и руководство по программному обеспечению UPCL, выполните анализ для определения концентрации афлатоксина в исследуемых образцах.
Для отделения стильбеноидов используйте градиент, состоящий из воды, метанола и 88% муравьиной кислоты с определенными процентными условиями и временем. Установите скорость потока на 0,5 миллилитра в минуту и время работы на 12 минут. Используя метод калибровочной кривой, определите концентрации стильбеноидов и сравните пиковые площади исследуемого образца с чистыми, подлинными стандартами.
Метод количественного определения афлатоксина на основе УПЛК позволяет добиться чувствительного количественного определения афлатоксина В1 с пределом в два пикограмма на инъекцию. Очищенный экстракт семян, собранных с дикого вида Areca, показал однозначное количественное определение афлатоксинов. Колонный подход с силикагелем магния эффективно удаляет примеси из афлатоксиновой фракции и демонстрирует высокую эффективность количественного определения в отличие от предыдущих методов.
Кроме того, этот метод также помогает в количественном определении фитоалексинов арахиса.
