Получение рекомбинантных AAV методом транзиторной трансфекции

Для начала планшет HEK293T клетки, добавив 22 миллилитра питательной среды в 10 обработанных чашках для культивирования диаметром 15 сантиметров. Инкубируйте планшеты в течение 24 часов, чтобы достичь конфлюенции от 70 до 80%. Для трансфекции клеток приготовьте смесь, соединив реагенты в микроцентрифужной пробирке, и перемешайте путем постукивания.

Добавьте трансфекционную смесь к 4,56 миллилитров недополненного DMEM в 50-миллилитровую центрифужную пробирку и перемешайте постукиванием. Затем по капле добавляем 1,37 миллилитра стерильного раствора полиэтиленимина. Перемешать постукиванием и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут до образования комплексов ДНК-полиэтиленимина.

Добавьте эту смесь в 231 миллилитр предварительно подогретого дополненного ДМЭМ. Замените питательную среду в каждой чашке для культивирования 22 миллилитрами этой смеси для трансфекции и инкубируйте клетки в течение 48 часов. Если PITR кодирует флуоресцентный репортер, наблюдайте за трансфицированными клетками под флуоресцентным микроскопом.

Далее соберите медиум из каждой посуды. Центрифугируйте при 800G в течение 10 минут и удалите надосадочную жидкость. Затем добавьте в тарелку 10 миллилитров предварительно подогретого PBS и удалите клетки скребком для клеток.

Соберите клеточную суспензию в центрифужные пробирки, содержащие клеточную гранулу. Убедитесь, что все клетки собраны, вымыв пять посуды за один раз 10 миллилитрами PBS. Снова центрифугу, чтобы гранулировать ячейки.

Для экстракции rAAV разморозьте трансфицированные клеточные гранулы и повторно суспендируйте в 100 миллилитрах стерильного буфера и пипетки, чтобы получить однородную суспензию. Затем добавьте 12,5 миллилитров свежеприготовленного стерильного 10% раствора дезоксихолата натрия, чтобы вызвать лизис клеток, и перемешайте с помощью пипетирования. Добавьте 27 микролитров нуклеазы бензоназы и тщательно перемешайте, пока смесь не перестанет быть вязкой.

Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия, каждые 10 минут, в течение одного часа. Центрифугируйте при 3 000 G в течение 60 минут при 25 градусах Цельсия. Отфильтруйте надосадочную жидкость с помощью шприцевого фильтра PVDF 0,45 микрона в новый стерильный контейнер.