Для начала подготовьте систему FPLC к очистке. Тщательно промойте канал потока жидкости стерильной сверхчистой водой, следуя инструкциям по эксплуатации или индивидуальному методу. Подключите одномиллилитровую предварительно упакованную колонку с гепарином.
Отрегулируйте сигнализацию давления. И промыть пятью столбами объемы сверхчистой воды со скоростью расхода один миллилитр в минуту. Затем переключите растворы для системных насосов, чтобы подготовить их к нанесению образца.
Промойте системный насос B буфером B и заполните остальную часть пути потока жидкости буфером A. Вставьте трубку для отбора проб насоса для отбора проб в вирусный препарат. В качестве альтернативы используйте суперцикл для примера. Вставьте выпускную трубку в новую емкость.
При первом выполнении очистки определите индивидуальный метод автоматической очистки. После включения общих настроек очистки метод заправляет раствором образец путь потока от входа образца S1 к клапану впрыска. Затем уравновесьте колонку в общей сложности пятью объемами колонны, используя 12,5% буфера B со скоростью один миллилитр в минуту.
Нанесите пробу на колонку со скоростью 0,5 миллилитра в минуту и соберите поток с помощью выпускного отверстия. Промойте колонку 20 объемами буфера А из расчета один миллилитр в минуту. Затем разводите образец со скоростью один миллилитр в минуту по этой схеме.
Выберите, чтобы собрать элюированный образец на доли в один миллилитр с помощью коллектора фракций. Затем повторно уравновесьте колонку со скоростью один миллилитр в минуту с 12,5% буфера B для пяти объемов колонки. Откройте созданный метод и дождитесь шага элюирования.
Соберите дроби с помощью коллектора фракций. Кроме того, соберите аликвоту протекания и храните фракции при температуре минус 20 градусов Цельсия. Оцените автоматически сохраненную хроматограмму всех этапов очистки.
В том числе и профиль элюирования. После завершения переключите входные отверстия с буферных растворов на сверхчистую воду и промойте колонку со скоростью один миллилитр в минуту для пяти объемов колонны. Восстановив колонну, переключите входные отверстия со сверхчистой воды на 20%-ный этанол и промойте колонну на пять объемов колонны.
Для концентрирования rAAV загрузите желаемые фракции FPLC в 15-миллилитровый центробежный фильтрующий блок с отсечкой молекулярной массы 100 килодальтон. Центрифугируйте при 2000 G в течение двух минут при комнатной температуре, чтобы достичь концентрированного объема примерно 500 микролитров. Продолжите замену буфера, добавив один миллилитр стерильного PBS в блок центробежного фильтра.
Промыть фильтр пипеткой. И центрифугировать с интервалом в одну минуту до достижения объема в 500 микролитров. Далее концентрируйте rAAV, перенося этот образец объемом 500 микролитров в 0,5-миллилитровый центробежный фильтр с отсечкой 100 килодальтон.
И центрифугирование при 6 000 G с интервалом в одну минуту до тех пор, пока объем не станет менее 100 микролитров. Рекуперация концентрированного rAAV путем инвертирования фильтрующего устройства в новую микроцентрифужную пробирку и центрифугирования для переноса rAAV в пробирку. Поместите rAAV в микроцентрифужные пробирки с низким удержанием и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия.
Чистоту препаратов rAAV анализировали с помощью страницы SDS, выявляя отчетливые полосы капсидных белков. Визуализация вирусных частиц с помощью ПЭМ показала пустые частицы с электронно-плотным центром и полными частицами. Оценка физических примесных свойств rAAV с использованием платформы stunner выявила интактные частицы капсида размером около 30 нанометров, общий титр капсида, свободный и агрегированный белок и одноцепочечную ДНК.
Анализы инфекционности в клетках нейро2а показали высокий уровень инфекционности. Продемонстрированы первичные культуры нейронов, инфицированные вирусными препаратами. сохраненные свойства переноса генов.
Трансдукция мозжечка мышей in vivo векторами rAAV приводила к длительной экспрессии GFP. Указывает на успешную экспрессию трансгена в мозге млекопитающих.
