Иммуноокрашивание органоидов, полученных из колоректального рака, в пептидном гидрогеле

Для начала пипетируйте 20 микролитров капель пептидного гидрогеля в 24-луночный планшет. Посадите 800 клеток клеточной линии SW1222 в каждую лунку на четыре дня. На четвертый день выведите среду пипеткой.

Промойте каждую лунку два раза PBS. Затем добавьте в лунки 400 микролитров 4%-ного раствора формальдегида. После завершения инкубации используйте наконечник для пипетки P1000 для аспирации раствора формальдегида.

Затем еще раз промойте лунки PBS. Инкубируйте клетки в одном миллилитре буфера для пермеабилизации в течение 30 минут при комнатной температуре. После пипетирования буфера и промывки лунок PBS добавьте 0,5 миллилитра блокирующего буфера.

Теперь промойте лунки PBS после снятия блокирующего буфера. Затем пипеткой внесите в лунки 200 микролитров разведенного первичного антитела. Инкубируйте тарелку на ночь при температуре четыре градуса Цельсия.

С помощью наконечника для дозатора P200 удалите раствор. Затем промойте лунки раствором PBS. Далее добавьте конъюгат фаллоидина во флакон разведенного вторичного антитела в соотношении один к 40.

Нанесите эту смесь пипеткой в лунки тарелки. Затем выдержите пластину при комнатной температуре в течение трех часов в темноте. После отсасывания раствора и промывки лунок PBS пипеткой в каждую лунку нанесите пипеткой по 300 микролитров раствора DAPI.

После инкубации промыть лунки PBS еще раз после пипетирования раствора. Храните тарелку при температуре четыре градуса Цельсия до семи дней. Иммуноокрашивание показало, что органоиды, обнаруженные в небиофункциональном пептиде Р, биофункционализированном пептиде Р1 и Матригеле, локализованы в апикальных и базолатеральных мембранах.

Небиофункциональный пептид Р индуцировал экспрессию межклеточного соединения в базолатеральной мембране.