Для начала погрузите флакон с криоконсервированными HUVEC в водяную баню при температуре 37 градусов на две минуты. Затем промойте флакон 70% этанолом, чтобы предотвратить загрязнение. Пипеткой введите пять миллилитров предварительно подогретого ЭКГ в коническую трубку объемом 15 миллилитров.
С помощью микропипетки аккуратно переложите размороженные клетки из флакона в коническую пробирку. Затем добавьте один миллилитр свежей предварительно подогретой среды в криовиал, чтобы промыть изнутри и перенести оставшиеся клетки в коническую трубку. После выброса надосадочной жидкости повторно суспендируйте клетки в 10 миллилитрах свежей среды.
Затем переложите ячейки в колбу Т75. Инкубируйте колбу в увлажнённом углекислом бассейне при температуре 37 градусов Цельсия. Промойте 90% слитые клетки HUVEC в колбе T75 с 10 миллилитрами DPBS.
Затем добавьте в колбу один миллилитр 0,25%TE. После инкубации аккуратно постучите по стенкам колбы и добавьте пять миллилитров нейтрализующего раствора трипсина. Затем переложите клетки в коническую трубку объемом 15 миллилитров.
Соберите оставшиеся клетки с пятью миллилитрами свежей ЭКГ и перенесите их в коническую трубку. Теперь центрифугируйте коническую трубку при давлении 250 x g в течение трех минут, чтобы собрать клеточную гранулу. После отбрасывания надосадочной жидкости повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре свежей ЭКГ и подсчитайте клетки.
После повторного центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 90 микролитрах свежего ЭКГ. Затем кратковременно вакуумируйте каналы напечатанных сосудов-на-пластине, чтобы очистить просвет. С помощью микропипетки аккуратно загрузите в канал 15 микролитров клеточной суспензии HUVEC.
Поместите пластину в инкубатор на два часа. Впоследствии переверните пластину на 180 градусов, поддерживая ее в ровном положении в течение следующих двух часов. Через четыре часа промойте канал DPBS, чтобы удалить неадгезивные и омертвевшие клетки.
Затем пипеткой внесите по два миллилитра свежего ЭКГ в каждую лунку. Поместите динамическую культуру на качалку под углом наклона 10 градусов и со скоростью вращения пять оборотов в минуту. Клетки HUVEC быстро прикреплялись и пролиферировали, покрывая просветную поверхность сосудистых каналов VOP.
Созревание эндотелия верифицировали методом иммуноокрашивания на CD31 через 5 суток после посева клеток, что продемонстрировало локализацию CD31 в узких местах соединения.
