Метод непрерывного градиента для очистки свиных островков

Для начала установите насос на расход 200 миллилитров в минуту и загрузите 125 миллилитров градиентного раствора высокой плотности в формовщик непрерывного градиента, а затем в процессор ячейки. Запустите функцию центрифуги процессора ячеек при 1 000 об/мин. Выпустите воздух из системы и повторите его с помощью градиентного решения высокой плотности.

Затем добавьте в образователь градиента 125 миллилитров градиентного раствора высокой плотности и 130 миллилитров раствора низкой плотности. Загрузите 100 миллилитров переваренной тканевой суспензии. Увеличьте частоту процессора ячейки до 2 000 об/мин в течение трех минут.

Чтобы приготовить 16 50 миллилитровых конических пробирок для сбора очищенной островковой фракции, добавьте в каждую пробирку по 25 миллилитров среды RPMI и расположите их в порядке возрастания. Соберите очищенные островковые фракции в подготовленные конические пробирки. Чтобы окрашивать островки, соберите от 100 до 200 микролитров аликвот из каждой очищенной фракции островков и оцените содержание островков с помощью окрашивания DTZ в 24-луночном планшете для культуры тканей.

Осмотрите каждую фракцию с помощью световой микроскопии при 4-кратном увеличении, где островки будут казаться от темно-красного до черного. С использованием этого протокола была проведена изоляция островков поджелудочной железы у трех свиней. На снимках светлого поля были видны очищенные островки поджелудочной железы, которые были охарактеризованы на жизнеспособность с помощью окрашивания живыми/мертвыми.

Репрезентативное распределение островков по размерам после выделения островков показало распределение по размерам от 50 до 100 микрон. Кроме того, выход и чистоту оценивали с помощью счетчика островковых клеток, что указывает на эффективную изоляцию поджелудочной железы свиней.