Этот метод может быть использован для вскрытия свиной поджелудочной железы, содержащей соединение, двенадцатиперстной и splenic долей и в конечном итоге децеллюляризации через перфузии моющих средств при низких температурах. Хотя этот метод децеллюляризации дает представление о свиной поджелудочной железы, он также может быть применен к pancreata от других крупных животных. Основным преимуществом этой техники является то, что она облегчает неповрежденный поиск сложного органа, такого как поджелудочная железа, для дальнейшего применения в области тканевой инженерии.
Как правило, лица, новые для этого метода, они будут бороться, потому что вскрытие нетронутой поджелудочной железы при выявлении и лигации всех окружающих кровеносных сосудов требует много практики, чтобы освоить. Перед началом процедуры используйте одну силиконовую трубку три на пять миллиметров для подключения контейнера для моющих средств к перистальтическому насосу и вторую силиконовую трубку три на пять миллиметров для подключения перистального насоса к камере органа через дегассер. Подключите самца Luer к свободному концу второй трубки и используйте третью силиконовую трубку три на пять миллиметров для подключения камеры органа к контейнеру для сбора моющих средств через перистальтический насос.
Наконец, подключите двухмиллиметровую необрюхаемую пипету к свободным концам трубок в контейнере для моющих средств и контейнере для сбора моющих средств. Затем поместите установку децеллюляризации при четырех градусах по Цельсию. Чтобы собрать поджелудочную железу, поместите гепаринизированную, 45-килограммовую самку свиньи на стол для вскрытия в положении на спине, и используйте скальпель, чтобы сделать 40-сантиметровый разрез средней линии от процесса кифоида до лобковой кости, чтобы разоблачить органы брюшной полости.
После выявления splenic, двенадцатиперстной и связи доли, найти основные двенадцатиперстной сосочки, и использовать два отдельных швов устно ligate двенадцатиперстной части от сайта. Ligate нижней пищевода с дополнительными швами, и вырезать между лигатуры с ножницами для облегчения удаления желудка. Отделить соединительной ткани от толстой кишки, чтобы достичь тонкой кишки, и отделить соединительной ткани толстой кишки, которая придает splenic доли поджелудочной железы.
Тонкий кишечник прикрепляется к поджелудочной железе соединительной тканью на splenic долей, но также окружает поджелудочную железу. Вы должны тщательно следовать кишечной путь, чтобы распутать и отделить соединительной ткани между кишечником и поджелудочной железой. После перевязки артерий, удалить толстой кишки из тонкой кишки.
Определите нижнюю мезентерическую вену, нижнее дерево мезентерической артерии, и лигат сосудов с одним швом caudal к поджелудочной железе и вырезать ножницами. Ligate селезенки артерии и вены вместе в hilum, близко к селезенке, и сократить distally с ножницами, чтобы удалить селезенку. Следуйте двенадцатиперстной части до двенадцатиперстной и связи доли очищены, и ligate двенадцатиперстной нотей в конце с двумя отдельными швами.
Часть двенадцатиперстной клетки, которая находится в тесном контакте с соединением и двенадцатиперстной клетки удаляется с поджелудочной железы, как перевязка всех мелких кровеносных сосудов между двумя органами слишком сложно. После вскрытия вены портала, ligate сосуд с одним швом, чтобы предотвратить утечку крови из печени, и вскрыть и ligate желчных протоков и печеночной артерии с двумя швами. Затем вырезать портальный вены, печеночным артерии, и желчный проток с ножницами.
Найдите аорту под почечной веной и рассеките аорту в направлении черепа от мышц и соединительной ткани до тех пор, пока сосуд не достигнет поджелудочной железы. Теперь, осторожно перевернуть поджелудочной железы, и вскрыть аорту, сохраняя высший мезентерической артерии и целиакии ствол нетронутыми. Вырезать аорты черепной к целиакии ствола, и тупой вскрыть оставшиеся окружающие ткани, чтобы урожай поджелудочной железы.
Затем используйте 50-миллилитровый шприц, подключенный к четырехмиллиметровой канюле артериотомии, чтобы промыть орган через аорту раствором два до тех пор, пока весь орган не будет пролит или пока весь орган не остынет. Поместите раствор два пролитой поджелудочной железы на металлический лоток на льду, с аортой лицом вверх, и использовать ножницы, чтобы вырезать швы из двенадцатиперстной клетки. Используйте 25-миллилитровую пипетку, чтобы промыть двенадцатиперстную часть с 50 до 150 миллилитров ультрачистой воды, и религейт ткани со свежими швами.
Ligate один конец аорты и все ветви, за исключением верхней мезентерической артерии и целиакии ствола, чтобы предотвратить утечку, и вставить четырехмиллиметровую артериотомию канюли в другой конец аорты. Затем поместите поджелудочную железу в органную камеру и соедините канюлю в поджелудочной железе с самцом Люера. Затем, perfuse поджелудочной железы с раствором три в течение одного часа на 20 миллилитров в минуту, и заморозить двойной пролитой поджелудочной железы при температуре минус 20 градусов по Цельсию в растворе четыре до начала децеллюляризации.
В день начала децеллюляризации оттаивать поджелудочную железу при четырех градусах по Цельсию и поменять оттаявленную поджелудочную железу в камеру органа децеллюляризации. Подключите моющую трубку к аорте поджелудочной железы и помойте поджелудочную железу раствором три на 20 миллилитров в минуту на ночь при четырех градусах цельсия. На следующее утро, decant любой раствор, оставшийся в камере органа, и perfuse поджелудочной железы в течение 30 минут при 20 миллилитров в минуту в растворе пять при четырех градусах по Цельсию.
В конце раствора пять перфузии, пронизывают поджелудочной железы в течение восьми часов при 20 миллилитров в минуту в растворе шесть и четыре градуса по Цельсию, а затем 96-часовой мыть в свежем растворе пять на 20 миллилитров в минуту и четыре градуса по Цельсию. Замените стирку 500 миллилитров DPBS, дополненных кальцием и магнием в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия, а затем перфузию с 250 миллилитров раствора семь в течение четырех часов при 20 миллилитров в минуту и 37 градусов по Цельсию. Затем промойте орган еще на 120 часов свежим раствором пять при 20 миллилитров в минуту и четыре градуса по Цельсию, и храните орган в растворе восемь.
Здесь можно наблюдать грубую морфологию нормальной поджелудочной железы, которая выглядит светло-розовой и содержит спленик, связь и двенадцатиперстную долей. После децеллюляризации розовый цвет теряется, а обработанная поджелудочная железа выглядит бледно-белого цвета. В нормальной поджелудочной железе, многие синие ядра очевидны H и E окрашивания, в то время как в децеллюляризованной поджелудочной железы ядра больше не могут быть визуализированы, подтверждающие их потерю.
Изолированные нетронутыми свиной поджелудочной железы, после этой процедуры, это позволит полной перфузии и успешной децеллюляризации при сохранении структуры, а также позволяет некоторые внеклеточные матричные белки, которые будут получены. Децеллюляризованная поджелудочная железа может быть использована для разработки стратегий рецеллюляризации всего органа в биореакторных системах с соответствующими типами клеток. После рецеллюляризации с реципиентом стволовых клеток, ткани инженерии поджелудочной железы могут быть использованы для клинического применения и тестирования на наркотики.
Не забывайте, что работа с Triton X-100 и SDC может быть чрезвычайно опасной и что меры предосторожности, такие как ношение перчаток и подготовка решений под капотом дыма, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
