Для начала возьмите мышь CD 45.1 SMARTA возрастом от шести до восьми недель и введите ей 200 микрограммов пептида LCMV GP 61-77 в 100 микролитров среды RPMI внутривенно. После получения спленоцитов от мыши суспендируйте их в 2% RPMI для достижения плотности клеток один умножить на 10 eighT-клеток на миллилитр и поместите пробирку с клетками на лед. Нанесите 50 микролитров клеточной суспензии вместе со 150 микролитрами окрашивающего буфера в каждую лунку 96-луночного планшета с круглым дном.
Центрифугируйте 96-луночный планшет при 800 G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия и осторожно сцедите надосадочную жидкость. Сделайте пластину вихревой и добавьте в каждую лунку по 200 микролитров буфера для окрашивания. После гранулирования клеток ресуспендировать и инкубировать их с поверхностным коктейлем антител на льду в течение 30 минут в темноте.
После двукратного промывания ресуспендируйте клетки в 200 микролитрах красящего буфера и переложите их в пробирку проточной цитометрии. Проведите анализ проточной цитометрии для проверки статуса активации CD4-положительных Т-клеток SMARTA. Затем засейте один раз по 10 раз шесть CD4-положительных Т-клеток SMARTA в лунку в 24-луночный планшет.
Раскрутите клетки при 800 G в течение трех минут при четырех градусах Цельсия и осторожно удалите надосадочную среду. Далее в каждую лунку добавьте по одному миллилитру ретровирусной среды и восьми микрограммам полибрена. Спин преобразует клетки при 800 G в течение двух часов при 37 градусах Цельсия.
После отбрасывания ретровирусной среды инкубируйте клетки с одним миллилитром предварительно подогретого 10% RPMI с добавлением интерлейкина 2. Переложите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте ее. После отбрасывания надосадочной жидкости повторно суспендируйте клетки с 2% RPMI для достижения плотности клеток от одного умноженного на 10 до восьмой клетки на миллилитр.
Для оценки эффективности трансдукции аликвот 50 мкл клеточной суспензии в круглое дно 96-луночного планшета. Инкубируйте их на льду с поверхностным коктейлем антител, включающим CD4, V альфа-два и антитела, ассоциированные с векторной меткой. Промойте клетки и проведите проточную цитометрию, как было показано ранее.
Затем введите один раз в 10 из шести CD 45.1 положительных SMARTA CD4 положительных Т-клеток мыши-реципиенту C57BL/6 внутривенно, а затем один раз в 10 раз в шесть единиц формирования бляшек LCMV Armstrong на следующий день. После получения спленоцитов от мыши, окрасьте их, чтобы проверить нужные маркеры. Чтобы обнаружить транскрипционные факторы, инкубируйте клетки с 200 микролитрами 2%-ного параформальдегида при комнатной температуре в течение 20 минут в темноте.
Наконец, проведите проточную цитометрию для выявления факторов на ранней стадии острой инфекции LCMV. На третьи сутки после инфицирования была обнаружена сбалансированная бифуркация фолликулярных хелперных Т-клеток и Т-хелперов 1 среди CD4-положительных Т-клеток MIGR1 SMARTA. Преобладающая фолликулярная хелперная Т-клеточная направленная дифференцировка и повышенные уровни экспрессии BCL6 наблюдались в MIGR1, BCL6, SMARTA, CD4-положительных Т-клетках.
