Введите от одного до трех миллиграммов флуорконъюгированного антитела против мыши CD45, разведенного в 100 миллилитрах нормального физиологического раствора, внутривенно каждой мыши, находящейся под наркозом. Начните с того, что поместите четыре миллилитра ледяного буфера HEPES, приготовленного в специализированную тканевую диссоциаторную трубку на лед для каждой мыши. После усыпления мыши поместите резецированные легкие в соответствующую дренажную трубку, охлажденную на льду.
Поместите трубки на автоматический диссоциатор тканей и запустите первую предустановленную программу для легочной ткани. Затем добавьте 500 микролитров стокового раствора либеразы и 500 микролитров стокового раствора аминогуанидина в каждую пробирку, содержащую диссоциированную легочную ткань. Инкубируйте его на миксере в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия.
После этого поместите трубки обратно на диссоциатор и запустите вторую предустановленную программу для легочной ткани. Теперь вылейте одноклеточную суспензию из трубки диссоциатора тканей через 100-микрометровое клеточное сетчатое фильтр в 50-миллилитровую коническую трубку. Промойте пробирку для диссоциатора тканей пятью миллилитрами полной EHAA и пропустите через ситечко в 50-миллилитровую трубку.
После снятия ситечка увеличьте объем клеточной суспензии до 50 миллилитров с помощью полного EHAA. Вместо использования специализированных трубок для диссоциации тканей поместите резецированные легкие в соответствующие 1,5-миллилитровые микрофуговые пробирки, охлажденные на льду. После того, как все легкие будут собраны, перенесите каждое легкое в свежую микрофугальную пробирку без какой-либо клеточной среды.
С помощью ножниц разрежьте легкие на мелкие фрагменты внутри микрофуговой пробирки. Добавьте по одному миллилитру либеразы ТМ и пищеварительного коктейля DNase I в каждую тюбик. Выдерживать 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия на водяной бане.
Затем вылейте образец через 100-микрометровое сетчатое фильтр, помещенное поверх 50-миллилитровой конической пробирки. Выведите оставшийся образец на ситечко. Разомните ткань о сетку резиновым концом поршня из стерильного одномиллилитрового шприца.
Промойте сетчатое фильтр с помощью буфера холодного сортировщика, собрав итоговый объем семь миллилитров в пробирку. Независимо от того, используется ли автоматический или ручной метод диссоциации, центрифугируйте полученную клеточную суспензию. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя после себя примерно 100 микролитров надосадочной жидкости и клеточную гранулу.
Наконец, добавьте примерно 100 микролитров блочного раствора Fc, чтобы довести общий объем до 200 микролитров, и энергично пересушите гранулу.
