Выделение и приготовление суспензии селезеночной селезенки мышей для анализа проточной цитометрии

Для начала поместите усыпленную мышь в лежачее положение на чистую скамейку. Разрежьте по средней линии брюшка мыши и отделите брюшные структуры слой за слоем. С помощью пинцета аккуратно вскройте большой сальник и живот.

Затем аккуратно вытащите селезенку с желудочно-селезеночной связкой и тупо отделите ее от окружающих тканей и связок для получения неповрежденной селезенки. Поместите клеточный фильтр 70 микрон в 100-миллиметровую стерильную чашку для культур. Добавьте селезенку в клеточное ситечко и раздавите его поршенем шприца.

Добавьте от пяти до восьми миллилитров гомогенатной промывочной жидкости, чтобы протолкнуть клетки селезенки через фильтр в чашку для культивирования. Центрифугируйте фильтрат при 450 г в течение пяти минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу с помощью разбавителя образца, входящего в комплект для разделения лимфоцитов.

После подсчета клеток на гемоцитометре отрегулируйте концентрацию клеток до 2 Х 10 в степени восьми клеток на миллилитр. В центрифужную пробирку возьмите такое же количество раствора для разделения лимфоцитов, как и тканевую суспензию одиночных клеток. Осторожно нанесите суспензию одиночных клеток на поверхность раствора для разделения лимфоцитов и центрифугируйте при плотности 800 г в течение 30 минут при температуре 25 градусов Цельсия.

После центрифугирования осмотрите четыре слоя в пробирке сверху вниз. С помощью пипетки аккуратно втяните кольцевидный молочно-белый слой лимфоцитов в другую пробирку. Добавьте в пробирку 10 миллилитров чистящего раствора, чтобы перемешать клетки.

Центрифугируйте клеточную суспензию при 250г в течение пяти минут. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах среды RPMI 1640 для подсчета клеток.