Эта работа была поддержана грантами NIH (5U01CA137070) и Американского онкологического общества (RSG-09-070-01-LIB), Научно-исследовательский институт рака Следователь премии (MK), Американской ассоциации сердца предварительно докторских стипендий (КМ) и испанского Министерства образования и науки стипендий (ПНГ). Мы хотели бы поблагодарить д-ра Николая Restifo и д-р Ю. Zhiya (NIH / НИР) за полезные предложения к протоколу.

1. Подготовка Ретровирусные Построить <ol><li> Sub-клон Т-клеточный рецептор (TCR) гена в ретровирусные вектора (рис. 1, например векторы PMSG 7, pMIGII 5,8, pMXs от Cellbiolabs). TCR α и β ген цепи должны быть на тот же вектор под контролем того же промотора для обеспечения равного выражения. Если TCR интересов человека, человека константные домены должны быть заменены с помощью мыши константных доменов 9. Наши наблюдения является то, что всю длину человеческой ТКО не стабильно выразить на мышь Т-клеток. </li><li> Подготовка высококачественных плазмидой ДНК с использованием Qiagen Maxi Prep Kit или аналогичный продукт. Концентрация плазмиды должна быть на уровне около 1 мкг / мкл. </li></ol> 2. Трансфекция и Т-клеточного Изоляция День 1 (клетки пластины упаковка) <ol><li> Выбить Платиновый-E (Плат-E, Cellbiolabs) ретровирусных клетки упаковки с помощью трипсина-EDTA и нейтрализовать с DMEM СМИ. </li><li> Центрифуга клетки при 1000 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в DMEM СМИ. </li><li> Определить номер ячейки и разбавленных клеток 0.6x10 6 / мл. Пластина 10 мл клеточной суспензии в 10 мм поли-лизин покрытием планшета для культуры ткани и расти ночь в камере инкубатора при 37 ° C, 5% СО 2. </li></ol> День 0 (трансфекции) <ol start="4"><li> Следующим утром, исследовать клетки под световым микроскопом. Камеры должны быть примерно на 80% вырожденная. </li><li> Аккуратно снимите СМИ от пластины. Вымойте клетки сразу с 1x PBS и добавьте 10 мл подогретого, свежие DMEM СМИ без Пенициллин-Стрептомицин (Pen / Strep). (Примечание: Ручка / Strep может помешать трансфекции) </li><li> Подготовка трансфекции комплекса. Подготовка смеси А и В следующим образом: <table border="0"><tbody><tr><td> Mix: ДНК плазмиды </td><td> 9 мкг </td></tr><tr><td> PCL-Эко помощник плазмиды </td><td> 6,3 мкг </td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> 1,5 мл </td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td> Mix B: Lipopfectime 2000 </td><td> 60 мкл </td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> 1,5 мл </td></tr></tbody></table> Инкубируйте и Б отдельно в течение 5 минут при комнатной температуре Смешать и В вместе мягко и инкубировать 20 минут при комнатной температуре до трансфекции комплекса. </li><li> Медленно капельного смеси (всего 3 мл) в Плат-E клеток. Осторожно пластину вперед и назад, чтобы распространять трансфекции смесь равномерно. </li><li> Инкубируйте клетки при 37 ° C / 5% СО 2 в камере инкубатора. </li><li> Через 6-8 часа заменить среду с 10 мл свежей среды DMEM (с ручкой / Strep) для вирусного производства. </li></ol> Пальто пластины с антителами <ol start="10"><li> Мышь Т-клетки должны быть активирована до вирусной трансдукции. Существуют различные способы активации Т-клеток. Здесь мы используем пластины связаны анти-CD3e и анти-CD28 антител. Подготовка антител смесь из 1 мкг / мл анти-CD3e и 2 мкг / мл анти-CD28 в стерильном PBS. </li><li> Внесите 250 мкл антител смеси в каждую лунку 24-луночного планшета для культуры ткани. Пластины могут быть покрыты в течение ночи при 4 ° С или 2 часа при температуре 37 ° C. </li></ol> Подготовка одного суспензии клеток селезенки от мышей <ol start="12"><li> Урожай селезенки мышей и трансфер в среде RPMI. </li><li> Место селезенки в камере фильтра. Маш селезенки поршень шприца на 5 см пластина культуры ткани. Промойте клетки от ячейки фильтра стерильной PBS. </li><li> Центрифуга 1000 мкг, 5 мин. </li><li> Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок клеток в буфере ACK лизирующего (2 мл на селезенки). Инкубируйте от 2 до 3 минут при комнатной температуре. Добавить RPMI среде до 20 мл и 1000 мкг центрифуги в течение 5 мин. </li><li> Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок клеток в стерильных PBS. Определение количества клеток и центрифуги 1000 мкг в течение 5 мин при 4 ° C. Приступить к изоляции Т-клеток. </li></ol> Выделение и активация мышью Т-клеток <ol start="17"><li> Магнитное этикетке клеток в соответствии с руководством по продукции (CD8 + Т-клеток изоляции комплект от Miltenyi Biotec). </li><li> Место LS колонке (Miltenyi Biotec) в мagnetic области. Применение меченых клеточную суспензию в колонку. Сбор проточные (обогащенный мыши CD8 + T-клеток). Промыть колонку в три раза с 3 мл буфера в соответствии с руководством по продукции и комбинировать с предыдущими проточные. </li><li> Пятно клетки с анти-CD3e и анти-CD8a антител и анализировать с помощью проточной цитометрии (рис. 2а). Для типичного разделения, ~ 8-10% от общего числа клеток может быть изолирован. ~ 90% от изолированной клетки CD8 + Т-клеток. </li><li> Центрифуга клетки при 1000 мкг, 5 мин. Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок клеток в среде RPMI с рекомбинантным человеческим IL-2 (rhIL2, 20 нг / мл) при 1х10 6 / мл. </li><li> Просто, прежде чем добавить соты, удалить раствор антител от пластины (подготовленные ранее в 2.11). Промыть каждую лунку стерильной PBS и удалить PBS. </li><li> Добавить 1 мл клеточной суспензии в каждую лунку. Положите пластины при температуре 37 ° C / 5% СО 2 в камере инкубатора. </li></ol> 3. (2-й день и День 3) Заражение активированных Т-клеток <ol><li> Через 2 дня вируса производства, среды, в Плат-E ячейки пластины должны стать желтым. Передача вирусного супернатанта в 15 мл коническую трубку. Добавьте 10 мл свежей среды DMEM к пластине для дальнейших вирусных производства (опционально). </li><li> Центрифуга вирус супернатант при 1000 мкг в течение 5 минут, чтобы удалить клетки мусора. Тщательно передачи вируса супернатант в новую пробирку. Оставьте немного жидкости на дне пробирки и не беспокоить клетки мусора. </li><li> Сбор активированных Т-клеток с пластинки в 50 мл коническую трубку. Определить число клеток. Сохранить некоторые клетки в отдельную трубку для использования в качестве отрицательного (ООН-трансдуцированных) контроля. Центрифуга при 1000 мкг в течение 5 мин и отбросить супернатант. </li><li> Ресуспендируют осадок клеток в вирус супернатант на 10 6 клеток в 1 мл с 20 нг / мл rhIL2 и 10 мкг / мл протамина сульфата. Добавить 1 мл клеточной суспензии в каждую лунку 24-луночный планшет. Ресуспендируют клеток в контрольную пробирку в среде RPMI при одинаковой плотности ячейки с таким же количеством rhIL2 и протамина сульфата. Добавить клетки той же пластинке. </li><li> Оберните пластину с пластиковой пленкой. Центрифуга 90 минут при 2000 мкг, при 32 ° C, без тормозов. </li><li> После центрифугирования, удалить пленки. Добавьте 1 мл свежей среды RPMI с 20 нг / мл rhIL2 в каждую лунку. Положите пластину обратно в инкубатор. </li><li> (Дополнительно) высшего уровня экспрессии TCR может быть достигнуто путем сбора вируса супернатант и повторяющиеся инфекции процедуры в день 3. </li></ol> 4. Расширение клетки и оценка эффективности трансдукции <ol><li> Изучить трансдуцированных Т-клеток в день. Разделение клеток в соотношении 1:03, когда это необходимо в RPMI среду rhIL2. Не позволяйте клетки разрастаются (средний желтеет). </li><li> В день, 6 или 7 дней, пятно клеток с антителами и МНС тетрамер специфичные для ТКС для вычисления выражения ТКР на Т-клеточной поверхности. Использование не-трансдуцированных Т-клеток в качестве контрольных (рис. 2). </li><li> Трансдуцированных Т-клетки готовы к дальнейшему течению приложений. </li></ol> 5. Представитель Результаты Очень часто выгоднее, чтобы очистить Т-клеточных подмножеств до трансдукции хотя спленоцитов можно трансдуцированных без очистки. Высокая чистота Т-клеточных подмножеств может быть получена с использованием коммерческих магнитных шариков (рис. 2а). Для оценки уровня экспрессии ТКО на Т-клетки, антитела, специфичные для TCR альфа-или бета-цепи могут быть использованы. Обычно 30% до 80% клеток может выразить трансдуцированных TCR (рис. 2, б) в зависимости от генов TCR и вирусные титры. MHC тетрамер специфичные для TCR также может быть использована для дальнейшего проверить функциональное выражение ТКО (рис. 2в). <img src="/files/ftp_upload/2307/2307fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Пример Т-клеточный рецептор гена построить к югу от клонировали в ретровирусного вектора. Полная длина альфа-и бета-гены цепочки связаны между собой самостоятельно расщепляемого 2А пептидный линкер 8. <img src="/files/ftp_upload/2307/2307fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. Пример успешного изоляции и трансдукции мыши Т-клеток. () CD8 T-клетки были выделены из спленоцитов использованием CD8a + Т-клеток изоляции Kit (Miltenyi Biotec) и окрашивали анти-CD3e и анти-CD8a антител. Изолированные CD8 T-клетки трансдуцированных с R6C12 TCR специфичны для человека gp100: 209 -217 4 пептида и окрашивали анти-человеческий Vbeta 8 антител (б) и HLA-A2kb gp100 тетрамер (с).

<ol>
	<li>Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+T+cells+'see'+antigen.">How T cells 'see' antigen.</a> Nat. Immunol. 6, 239-245 (2005).</li><li>Berg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen/MHC-specific+T+cells+are+preferentially+exported+from+the+thymus+in+the+presence+of+their+MHC+ligand.">Antigen/MHC-specific T cells are preferentially exported from the thymus in the presence of their MHC ligand.</a> Cell. 58, 1035-1046 (1989).</li><li>Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection.">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76, 17-27 (1994).</li><li>Yu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poor+immunogenicity+of+a+self/tumor+antigen+derives+from+peptide-MHC-I+instability+and+is+independent+of+tolerance.">Poor immunogenicity of a self/tumor antigen derives from peptide-MHC-I instability and is independent of tolerance.</a> J. Clin. Invest. 114, 551-559 (2004).</li><li>Holst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice.">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).</li><li>Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+regression+in+patients+after+transfer+of+genetically+engineered+lymphocytes.">Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes.</a> Science. 314, 126-129 (2006).</li><li>Hawley, R. G., Lieu, F. H., Fong, A. Z., Hawley, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+retroviral+vectors+for+potential+use+in+gene+therapy.">Versatile retroviral vectors for potential use in gene therapy.</a> Gene Ther. 1, 136-138 (1994).</li><li>Szymczak, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+multi-gene+deficiency+in+vivo+using+a+single+'self-cleaving'+2A+peptide-based+retroviral+vector.">Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector.</a> Nat. Biotechnol. 22, 589-594 (2004).</li><li>Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antitumor+activity+of+murine-human+hybrid+T-cell+receptor+(TCR)+in+human+lymphocytes+is+associated+with+improved+pairing+and+TCR/CD3+stability.">Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability.</a> Cancer Res. 66, 8878-8886 (2006).</li><li>Letourneur, F., Malissen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+a+T+cell+hybridoma+variant+deprived+of+functional+T+cell+receptor+alpha+and+beta+chain+transcripts+reveals+a+nonfunctional+alpha-mRNA+of+BW5147+origin.">Derivation of a T cell hybridoma variant deprived of functional T cell receptor alpha and beta chain transcripts reveals a nonfunctional alpha-mRNA of BW5147 origin.</a> Eur. J. Immunol. 19, 2269-2274 (1989).</li><li>Bendle, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethal+graft-versus-host+disease+in+mouse+models+of+T+cell+receptor+gene+therapy.">Lethal graft-versus-host disease in mouse models of T cell receptor gene therapy.</a> Nat. Med. 16, 565-570 (2010).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Несколько шагов имеют решающее значение для достижения оптимальных результатов. Плат-E упаковки клеточной линии следует иметь в здоровом состоянии. Если необходимо, ячейки могут быть пассировать несколько раз в среде DMEM с 1 мкг / мл пуромицина, 10 мкг / мл blasticidin для предотвращения потери ретровирусных выражение структуры белка. В день трансфекции клетки должны быть ~ 80% вырожденная. Слишком мало или слишком много клеток может привести к снижению титра вируса. Вирус качества может быть проверена путем тестирования на клеточных линий, которые могут быть легко трансдуцированных. С ТКО требуют CD3 комплексов, которые будут высказаны на поверхности клеток, мы обычно используем 58α-/β- гибридомных клеток 10 (клеточная линия, что не выражает эндогенных TCR α или β цепи, но не выразить CD3 комплекса). Получено почти 100% эффективностью трансдукции гибридомных клеток при трансдукции клеток с 1 мл вируса супернатант. Наконец, Т-клетки должны быть активизированы и пролиферирующих потому что ретровирус может только заразить активно делящихся клеток. Метод, представленный здесь для получения антиген-специфических Т-клеток имеет ряд ограничений. Во-первых, трудно достигать 100% эффективностью трансдукции для первичной мыши Т-клеток. Часть клетки не экспрессируют TCR интересов. Во-вторых, трансдуцированных TCR α и β цепи могут mispair с эндогенными ТКО 9, что может снизить уровень экспрессии TCR интересов. Кроме того, mispaired ТКО может вызвать аутоиммунные в естественных условиях 11. Наконец, есть только ограниченные сроки трансдуцированных Т-клетки могут быть использованы. Примерно через одну неделю, клетки подвергаются апоптозу, если повторной стимуляции. Тем не менее, клетки могут стать исчерпаны, и терять функций повторный запуск раздражениями.

СМИ: DMEM среде (DMEM +10% тепла инактивированной FBS + Pen / Strep + L-Glu + Натрий Пируват + Non-незаменимая аминокислота). DMEM среде без пера / Strep (То же, среда DMEM, но без добавления Pen / Strep). RPMI среды (RPMI +10% тепла инактивированной FBS + L-Glu + Non-незаменимая аминокислота β +-Mercaphoethanol + Pen / Strep + пируват натрия).

retroviral transduction of t-cell receptors in mouse t-cells

Т-клеточных рецепторов (TCR) играют центральную роль в иммунной системе. ТКО на Т-клеточной поверхности могут специально признать пептидные антигены, представленные антиген представляющих клеток (БТР) 1. Это признание ведет к активации Т-клеток и ряда функциональных результатов (например, продукции цитокинов, убийство клеток-мишеней). Понимание функциональной роли ТКО имеет решающее значение для использования возможностей иммунной системы для лечения различных заболеваний, связанных иммунологии (например, рака или аутоиммунных заболеваний). Это удобно для изучения ТКО на мышах, которая может быть выполнена несколькими способами. Создание TCR трансгенных мышах стоит дорого и отнимает много времени и в настоящее время Есть только ограниченное число их доступными 2-4. Кроме того, мыши с антиген-специфических Т-клеток может быть порождена костного мозга химера. Этот метод также занимает несколько недель и требует экспертных знаний 5. Ретровирусные трансдукции ТКО в в пробирке активированный мыши Т-клеток является быстрым и относительно простой способ получения Т-клетки желаемый пептид-МНС специфику. Антиген-специфические Т-клетки могут быть получены в течение одной недели и использовать в любых приложениях вниз по течению. Изучение трансдуцированных Т-клетки также имеет прямое отношение к человеческой иммунотерапия, как приемные передачи человеческих Т-клеток трансдуцированных с антиген-специфические ТКО является новой стратегией для лечения рака 6. Здесь мы приводим протокол retrovirally преобразовывать в ТКО в пробирке активированный мыши Т-клеток. Оба человека и мыши TCR генов могут быть использованы. Ретровирусы проведения специфических генов TCR генерируются и используются для заражения мышей Т-клетки, активированные с анти-CD3 и анти-CD28 антител. После того как в пробирке расширения, трансдуцированных Т-клетки анализировали с помощью проточной цитометрии.

Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells at JoVE.com

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Мы представляем протокол производить антиген-специфические Т-мышь клеток с использованием ретровирусной трансдукции

Ретровирусные трансдукция Т-клеточных рецепторов в мышь Т-клеток

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

retroviral-transduction-of-t-cell-receptors-in-mouse-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.5K Views.  New York University School of Medicine. Мы представляем протокол производить антиген-специфические Т-мышь клеток с использованием ретровирусной трансдукции

Video: Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

PiggyBac транспозонов модификации системы первичной Т-клетках человека

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

Аденовирусной трансдукции наивного CD4 Т-клеток по изучению Treg Дифференциация

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Вывод Т-клеток<em&gt; In Vitro</em&gt; От эмбриональных стволовых клеток мыши

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Мышь наивного CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток Выделение и<em&gt; В пробирке</em&gt; Дифференциация в Т-клеточных подмножеств

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Ретровирусное Трансдукция костного мозга клеток-предшественников для генерации Т-клеточного рецептора Retrogenic Мыши

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

порождающий<em&gt; De Novo</em&gt; Антиген-специфический человеческий Т-клеточный рецепторам трансдукции ретровирусных Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Ретровирусное трансдукция Т-хелперы как генетический подход к изучению механизмов, контролирующих их дифференцировку и функции

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

Изоляция мыши Почки-Резидент CD8 -Т-клетки для анализа цитометрии потока

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or microbial lipid antigens presented by the non-polymorphic MHC class I-related molecule CD1d. Preclinical and clinical studies support a role for iNKT cells in cancer, autoimmunity and infectious diseases. iNKT cells are very conserved throughout species and their investigation has been facilitated by mouse models, including CD1d-deficient or iNKT-deficient mice, and the possibility to unequivocally detect them in mice and men with CD1d tetramers or mAbs specific for the semi-invariant TCR. However, iNKT cells are rare and they need to be expanded to reach manageable numbers for any study. Because the generation of primary mouse iNKT cell line in vitro has proven difficult, we have set up a robust protocol to purify and expand splenic iNKT cells from the iV&#945;14-J&#945;18 transgenic mice (iV&#945;14Tg), in which iNKT cells are 30 times more frequent. We show here that primary splenic iV&#945;14Tg iNKT cells can be enriched through an immunomagnetic separation process, yielding about 95-98% pure iNKT cells. The purified iNKT cells are stimulated by anti-CD3/CD28 beads plus IL-2 and IL-7, resulting in 30-fold expansion by day +14 of the culture with 85-99% purity. The expanded iNKT cells can be easily genetically manipulated, providing an invaluable tool to dissect mechanisms of activation and function in vitro and, more importantly, also upon adoptive transfer in vivo.

We describe a rapid and robust protocol to enrich invariant natural killer T (iNKT) cells from mouse spleen and expand them in vitro to suitable numbers for in vitro and in vivo studies.

Очистка и расширение мышечных инвариантных естественных Т-киллеров для исследований in vitro и in vivo

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to assess calcium signaling by band-pass flow cytometry. This protocol is designed to measure calcium responses in primary murine T-cells using full spectrum flow cytometry. Total splenocytes are labeled with the ratiometric calcium indicator dye Indo-1, along with a panel of fluorochrome-conjugated antibodies to cell surface molecules. Leveraging the capabilities of full spectrum flow cytometry provides a platform for utilizing a wide array of cell surface stains in combination with Indo-1. Cells are then analyzed in real-time at 37 &#176;C before and after the addition of an anti-CD3 antibody to stimulate the T-cell receptor. After unmixing the spectral signals, the ratio of calcium-bound to calcium-free Indo-1 is calculated and can be visualized over time for each gated population of splenocytes. This technique can allow for the simultaneous analysis of calcium responses in multiple cell populations.

Calcium influx, a measure of T-cell signaling, is an effective way to analyze responses to T-cell receptor stimulation. This protocol for multiplexing Indo-1 with panels of antibodies directed at cell surface molecules takes advantage of the highly flexible capabilities of full spectrum flow cytometry.

Анализ индуцированного Т-клеточными рецепторами притока кальция в первичных мышиных Т-клетках методом проточной цитометрии полного спектра

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...