Для начала поместите предварительно нагретый носитель изображения и стерильные микроскопические чашки с покровными стеклянными поверхностями с покрытием или без покрытия на рабочую платформу. После удаления среды, окружающей агарозную форму, осторожно повторно суспендируйте содержимое форм в среде объемом 190 микролитров, прежде чем переложить плавающие сфероиды в двухмиллилитровый флакон. Для сфероидов в планшете с низким уровнем прикрепления перекладывайте сфероиды по одному из отдельных лунок во флакон.
Дайте сфероидам осесть на дне флакона в течение пяти минут, образуя видимую гранулу. Удалите среду из флакона, оставив сфероиды в покое, и аккуратно повторно суспендируйте их в достаточном количестве свежей среды McCoy's 5A. Теперь перенесите равное количество сфероидной суспензии на лунку микроскопической чашки.
Инкубируйте сфероид в течение 1–2 часов при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с углекислым газом. Добавьте флуоресцентный зонд к известному объему сфероидной суспензии и продолжайте инкубацию в течение 1 часа при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации замените среды, содержащие флуоресцентные зонды, на необходимый объем среды для визуализации.
Запустите программное обеспечение для управления микроскопом и инициализируйте калибровку предметного цикла. Затем выберите необходимую цель. Выберите окно «Открыть проект» и нажмите «Создать новый проект».
Затем щелкните правой кнопкой мыши по вновь созданному проекту и выберите опцию «Переименовать» в выпадающем меню. Присвойте файлу исследовательского проекта стандартное имя. Откройте окно Приобретение.
Установите импульс, белый свет, лазерное возбуждение, длину волны и необходимый диапазон гибридных или резонансных сканирующих детекторов. Затем выберите линейный или кадровый типы сканирования. В окне «Захват» выберите режим FLIM для выполнения визуализации в сочетании с подсчетом фотонов.
Затем выберите частоту повторения импульсов лазерного излучения белого света. Запустите предварительный просмотр изображения в режиме Fast Live и отрегулируйте точную фокусировку объекта изображения на интересующем вас участке. Глядя на гистограмму интенсивности пикселей, отрегулируйте соответствующий размер и разрешение точечного отверстия интенсивности лазера.
В режиме Fast Live задайте координаты и направление сканирования, а также присвойте им начало и конец в окне Z-Stack. Выберите размер z-шага или количество шагов. После того, как все необходимые настройки будут применены, приступайте к созданию образа.
Присвойте изображению соответствующее имя и сохраните проект изображения. Различные методы формирования привели к различным размерам сфероидов. Сфероиды HCT116 в планшетах с низким уровнем прикрепления были значительно больше через пять дней по сравнению с методами с высокой пропускной способностью.
Методы слабого прикрепления привели к явному развитию некротического ядра, обнаруженного при окрашивании йодидом пропидия. Напротив, сфероиды, полученные другими методами, продемонстрировали диффузное распределение мертвых клеток по телу сфероида. Оксигенация в сфероидах HCT116, полученных различными методами, показала более насыщенный кислородом сфероид с микротканью и лабораторными микроформами, чем в Sphericalplate 5D.
Сфероидная оксигенация сфероидов Sphericalplate 5D показала более низкую оксигенацию по сравнению с микротканями и лабораторными микроформами. Фазорный анализ сфероидов HCT116, выполненный с использованием пластин с низким уровнем прикрепления, выявил наличие гликолитических и негликолитических ядер через двухфотонный NADPH-FLIM.
