Оценка in vitro цитотоксичности, опосредованной чувствительными к гипоксии CAR-T-клетками

Для начала засейте 1000 клеток-мишеней в каждую лунку двух 96-луночных 96-луночных планшетов для культивирования тканей, содержащих 200 микролитров FBSDMEM. На следующий день тщательно пипеткой выведите по 100 микролитров надосадочной жидкости из верхней части каждой лунки. Добавьте Т-клетки химерного антигенного рецептора или нетрансдуцированные Т-клетки в 100 микролитров FBSDMEM в различных соотношениях.

Поместите одну тарелку в атмосферу с содержанием кислорода 21%, а другую — в передвижную камеру инкубатора с углекислым кислородом и азотом в атмосфере с содержанием кислорода 1%. После 24 часов совместного культивирования с помощью пипетки осторожно перенесите всю надосадочную жидкость в новую 96-луночную пластину U-образного дна. Храните надосадочную жидкость при температуре минус 20 градусов Цельсия для обнаружения цитокинов.

Теперь добавьте 60 микролитров буфера пассивного лизиса в каждую экспериментальную лунку черных 96-луночных планшетов с плоским дном. Поместите пластины на шейкер на 30 минут, чтобы обеспечить эффективный лизис клеток. Добавьте по 60 микролитров субстрата люциферазы светлячков в каждую экспериментальную лунку.

Используйте считыватель микропланшетов для немедленного измерения активности люциферазы. Наконец, рассчитайте нормированный процент цитотоксичности с помощью заданного уравнения. Чувствительный к гипоксии HER2, нацеленный на CAR, был способен эффективно убивать клетки-мишени независимо от того, была ли атмосфера гипоксической или нормоксической.

Напротив, HER2-BBz-ODD CAR T-клетки проявляли значительно более слабую цитотоксичность в нормоксических условиях для всех условий.