Клеточная диссоциация изолированных гаструлирующих эмбрионов мышей для секвенирования одиночных клеток

Приступайте к выполнению клеточной диссоциации изолированных эмбрионов мышей после подтверждения генотипов. С помощью пипетки P200 добавьте 50 микролитров DMEM с 10% FBS в новую 1,5-миллилитровую пробирку. После объединения эмбрионов с одинаковым генотипом в новую пробирку поместите ее на лед.

Дайте объединенным эмбрионам осесть на дно пробирки, затем промойте эмбрионы, используя 50 микролитров DPBS, и подождите, пока они осядут, прежде чем удалять как можно больше DPBS без извлечения эмбрионов. Затем добавьте 100 микролитров трипсина к объединенным эмбрионам и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в тепловом блоке в течение пяти минут. Осторожно поворачивайте 1,5-миллилитровую трубку каждые 30 секунд, чтобы помочь клеткам диссоциировать.

Через пять минут нейтрализуйте трипсин 300 микролитрами DMEM, содержащим 10% FBS. Центрифугируйте эмбрионы при 100 G в течение четырех минут при комнатной температуре. Полученную мелкую гранулу суспендируют в 40 микролитрах DMEM с 10% FBS и положите трубку на лед.

Смешайте пять микролитров клеточной суспензии с пятью микролитрами трипанового синего в новой 1,5-миллилитровой пробирке, и тщательно размывайте смесь пипеткой вверх и вниз. Перенесите смесь на предметное стекло, чтобы определить количество клеток и жизнеспособность с помощью автоматического счетчика ячеек. Наконец, приступайте к разделению одной клетки с помощью микрофлюидного чипа, следуя протоколу производителя.