Генотипирование в тот же день изолированных гаструлирующих эмбрионов мышей

После выделения висцерального желточного мешка из эмбриона мыши приступайте к расщеплению каждого желточного мешка в восьмиполосковой полимеразной цепной реакции или ПЦР-пробирке. С помощью пипетки P20 добавьте 19,3 микролитра ПЦР-матричного буфера для лизиса ДНК и 0,7 микролитра 0,2 микрограмма на миллилитр протеиназы K в каждый образец желточного мешка. Переведите образец на вихрь в течение 10 секунд.

И с помощью мини-центрифуги с адаптером для полоски убавьте количество образцов при 1000 G в течение 10 секунд. Поместите восьмиполосную ПЦР-пробирку в термоблок с температурой 85 градусов Цельсия на 45 минут, переворачивая в течение пяти секунд каждые пять минут. Через 45 минут снова поверните полоску пробирки при давлении 1000 G в течение 10 секунд, прежде чем приступить к ПЦР для желаемой генетической идентификации.

Чтобы провести реакцию ПЦР для генотипирования Cre, приготовьте мастер-смесь для ПЦР, содержащую отображаемые компоненты в восьмиполосной ПЦР-пробирке для каждого желточного мешка. Перейдите к запуску программы амплификации термического цикла ПЦР с использованием отображаемого цикла. Затем запустите продукты ПЦР на 1%-ном агарозном геле, чтобы сделать выводы по генотипированию.

Храните оставшиеся переваренные образцы желточного мешка в морозильной камере при температуре минус 20 градусов Цельсия для длительного хранения. При разделении продукта ПЦР на агарозном геле были видны ожидаемые размеры фрагментов для аллелей LoxP и дикого типа, а также аллеля Cre.