Для начала возьмите культивируемые клетки U2OS с конфлюенцией от 60% до 70% и разделите их с помощью 0,25% трипсина-ЭДТА. Подготовьте 60-миллиметровые пластины, добавив круглые 13-миллиметровые покровные листы. Пластина 400 000 ячеек в 60-миллиметровой пластине, содержащей несколько 13-миллиметровых круглых покровных колпачков.
Затем снимите питательную среду с пластин. Добавьте питательную среду, содержащую 25 микромолярных этопозидов, и инкубируйте клетки в течение 20 минут, 1 часа и 3 часов. После инкубации извлеките среду из тарелок.
Промойте клетки PBS три раза. Чтобы зафиксировать ячейки, добавьте ледяной метанол в объеме, достаточном для покрытия поверхности скольжения, и инкубируйте в течение 10 минут при температуре 20 градусов Цельсия. Затем промойте покровные листы с PBS три раза и перенесите их в камеру влажности.
После отключения PBS добавьте от 30 до 40 микролитров буфера для пермеабилизации и выдерживайте в течение 20 минут при комнатной температуре. После этого трижды промойте чехол PBS. Затем отключите PBS от образцов.
Добавьте от 30 до 40 микролитров раствора для блокировки, входящего в комплект PLA, в каждый чехол. Выдержите тарелку в предварительно разогретой влажной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 1 часа. Теперь разведите первичные антитела в разбавителе антител, входящем в комплект.
После выпуска блокирующего раствора добавьте первичный раствор антител в каждую защитную крышку и инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи в камере с влажностью. Разбавьте в разбавителе антитела зонды от одного до пяти. Используйте такие комбинации, как Donkey anti-Mouse MINUS с Donkey anti-Goat PLUS и Donkey anti-Mouse MINUS с Donkey anti-Rabbit PLUS.
Теперь вытрите из первичного раствора антитела и смойте один раз TBST. После постукивания излишков TBST добавьте 20 микролитров раствора зонда PLA в защитные стекла. Затем выдерживайте в предварительно разогретой влажной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 1 часа.
Разбавьте 5-кратный буфер для лигирования в воде высокой чистоты. Вытряхните раствор зонда PLA и промойте один раз TBST. Теперь добавьте лигазу в раствор для лигирования в разведении 1:40 непосредственно перед нанесением его на образцы.
Выдерживать в разогретой влажной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем разбавьте 5-кратный амплификационный буфер в воде высокой чистоты. После того, как раствор для лигирования будет удален из образцов, промойте образцы один раз TBST.
Добавляйте полимеразу в раствор для амплификации в соотношении 1:80 непосредственно перед нанесением ее на образцы. Выдерживать в разогретой влажной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 100 минут. Постучите по амплификаторному буферу, затем дважды промойте буфером SSC по 10 минут каждый.
После двукратной промывки образцов PBS добавьте раствор первичного антитела в каждую покровную прокладку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа. В конце инкубации оттолкните первичный раствор антител и трижды промойте TBST. Затем добавьте раствор вторичного антитела в каждую покровную пластину и инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут.
После этого промойте пять раз TBST, два раза буфером SSC и два раза буфером 0,01x SSC. Наконец, получите изображения из разных скважин или областей сдвига покрытия, чтобы избежать артефактов из-за неоднородной инкубации, и сохраните все каналы с одним и тем же именем.
