Генерация капель и цифровая капельная ПЦР для надежного количественного определения титров вирусного генома AAV в векторных образцах

Для начала подготовьте один обработанный образец AAV ДНК и dd_PCR мастер-микс. Добавьте 2,2 микролитра разведенного образца в 19,8 микролитра мастер-смеси dd_PCR каждую пробирку ПЦР-полоски из восьми пробирок и хорошо перемешайте. Перелейте 20 микролитров смеси в лунки, содержащиеся в среднем ряду образца картриджа, генерирующего капли.

Затем перекачайте 60 микролитров масла для генерации капель в лунки, содержащиеся в нижнем масляном ряду картриджа, генерирующего капли. Наденьте резиновую прокладку на картридж, генерирующий капли, а затем поместите его в генератор капель. После того, как капли будут сгенерированы, с помощью восьмиканальной пипетки медленно переведите 42,5 микролитра раствора из картриджа для генерации капель на многолуночный планшет для ПЦР.

Запечатайте ПЦР-планшет крышкой из алюминиевой фольги с помощью термосваривающей машины на пять секунд при температуре 180 градусов Цельсия. Для амплификации поместите планшет в термоамплификатор с реакционным модулем на 96 лунок, надежно закройте его и запустите программу ПЦР. После этого загрузите пластину в считыватель капель, введите необходимую информацию в системное программное обеспечение и начните считывание.

Четкое разделение между положительными и отрицательными каплями наблюдалось на графике 1D амплитуды, что свидетельствует об успешном измерении. Второй график 1D амплитуды показал дождь с каплями, разбросанными между положительным и отрицательным облаками, что указывает на потенциальную проблему с точностью измерений. Выходные данные прогона AAV показали стабильные результаты, когда один образец был измерен в дубликатах при двух разных разведениях.