Мы благодарим Сьюзен Фармер и коллектив ЗАО данио научно-исследовательский центр для рыбок данио помощи. Финансовые средства, предоставленные пуско-наладочные средств с кафедрой фармакологии и токсикологии.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был одобрен Университета Алабамы в Бирмингеме институционального комитета уходу и использованию животных. 1. Данио рерио Разведение и яичные Коллекции <ol><li> За три дня до начала воздействия химикатов, собрать размножения танки с разделителями в отдельных мужчин и женщин. Заполните каждый танк наполовину с системой аквакультуры воды. Использование сети, передавать Tg ​​(5xERE: GFP) c262/c262 рыбу рыборазводных аквариумах, размещение 2 мальчика и 3 девочки в каждом баке с перегородкой. Поместите крышку на каждом баке и этикетка с указанием даты и штаммов, которые будут скрещенными. </li><li> На следующее утро, снять все барьеры и наклона перегородки для создания мелководье на одном конце разведении танк. Разрешить данио к спариванию, сбора эмбрионов на 10-минутные интервалы для обеспечения точного постановку развития. Чистые яйца по полоскания через ситечко с помощью E3B среднего и осторожно промойте эмбрионов в чашки Петри. Вернуться взрослых рыб в постоянноетанки. </li><li> Использование рассекает микроскопом, сортировать, рассчитывать, и удалите все неоплодотворенные, аномальные или поврежденные эмбрионы. Место эмбрионов в чашках Петри в E3B средних и дома в 28,5 ° C с 14:10 свете: темно-цикла. Плотность эмбрионов может повлиять на развитие. Поместите не более 100 эмбрионов в мм блюдо 100 х 35 и не более 50 эмбрионов в мм блюдо 60 х 15. </li><li> К 24 часов после оплодотворения, замените носитель с E3B содержащей 200 мкм 1-фенил 2-тиомочевины (ПТУ). ПТУ предотвращает образование пигмента и держит эмбрионов данио и личинок прозрачную для улучшения четкости изображения. ВНИМАНИЕ: концентрированный ПТУ акции опасными; носить перчатки при принятии решения E3B + ПТУ. </li><li> В 1 день после оплодотворения (DPF), вручную удалить хориона от каждого эмбриона с использованием тонких щипцов. Хорион, кажется, не влияет проникновение эстрогенов, однако удаление увеличивает четкость изображения. Там нет необходимости, чтобы удалить хорионов из средств массовой информации. ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы ручной dechorionation, партии эмбрионов может быть чечески dechorionated с использованием 1 мг / мл проназы обработку, как описано выше 11. </li></ol> 2. Химическая обработка эмбрионов <ol><li> За день до лечения, подготовить исходные растворы каждого химического вещества в концентрации 1,000 раза в ДМСО (или соответствующем растворителе). Например, чтобы выставить эмбрионов до 10 мкм бисфенола А (BPA), подготовить исходный раствор 10 мМ BPA в 100% ДМСО. Это обеспечивает однородную концентрацию ДМСО в каждой обработки и позволяет нетоксичный 1:1000 разбавление ДМСО в качестве контроля транспортного средства. Магазин растворы при температуре -20 ° С. Для этого протокола, эмбрионы будут подвергаться воздействию 1 мкМ и 10 мкМ БФА, 18,5 нМ и 1,85 мкМ генистеина, 367 нМ эстрадиола (положительный контроль) и транспортного средства (0,1% ДМСО, отрицательный контроль). ВНИМАНИЕ: Химические вещества, такие как BPA и эстрадиола являются опасными и могут иметь негативное влияние на плода человека. Ручка эндокринные расстройства с осторожностью и всегда использовать средства личной защиты.</li><li> В день лечения, оттепель подготовлен фондовые химические растворы. Развести 1:1000 с помощью пипетки 1 мл E3B + ПТУ в 1,5 мл трубки микроцентрифужных и добавляя 1 мкл складе химического раствора. Vortex энергично. Развести ДМСО 1:1000 в E3B + ПТУ в качестве контроля транспортного средства. С помощью 1 мл E3b + PTU в 1,5 мл микроцентрифужных трубки в качестве необработанного контроля. </li><li> Использование большого отверстие пластик передачи пипетки, эмбрионы передачи из чашек Петри в каждую лунку 96-луночного планшета, 3 эмбрионов на лунку, 3 скважины в состоянии. Для предотвращения испарения в течение длительного лечения, опустить эмбрионов из внешних строк и столбцов пластины (строки А и Е, колонн 1 и 12). Внешние скважины могут быть заполнены 300 мкл E3B + ПТУ. Этикетка крышку пластины соответствующим образом. </li><li> Удалить вложение из каждой лунки с тонкой наконечником пластиковые пипетки. Работают быстро, чтобы избежать высыхания эмбрионов. </li><li> Добавить 200 мкл раствора для обработки в соответствующую лунку. Поместите крышку недеформированнойrneath пластину в качестве руководства для обеспечения добавление лечения в соответствующие лунки. Vortex каждая трубка до пипетки, чтобы распределить химического вещества в растворе. Визуально подтверждают друг эмбрион в обрабатывающем растворе. Если эмбрионы на стороне колодца, используйте чистую передачи пипетки, чтобы вымыть их в колодец с решением лечения. </li><li> Место пластины в инкубатор на 28,5 ° С. Эмбрионы будут проанализированы для флуоресценции при 72 часов после оплодотворения. </li></ol> 3. Автоматизированная изображений эмбрионов в 96-луночных <ol><li> Обезболить эмбрионов путем добавления 10 мкл 4 мг / мл Tricaine в каждую лунку. ПРИМЕЧАНИЕ: Обезболить эмбрионов до визуализации. В 24-96 часов после оплодотворения, данио демонстрируют самопроизвольное движение и ответ испуга к меняющейся источника света во время захвата изображения. Обезболивающий эмбрионов уменьшает движение во время съемки. </li><li> Место пластины 96-а в моторизованной стадии и калибровки на сцену. Использование Zeiss Zen синий 2011 программного обеспечения для микроскопии автоматизацна и контроль, выберите опцию образец носителя и выберите многоямного 96. Выберите калибровку. Следуйте пошаговой направления для калибровки на сцену. ПРИМЕЧАНИЕ: Не снимите кнопку плитки после этого шага. Если кнопка плитка не установлен, настройки калибровки могут быть потеряны и 96-луночный планшет необходимо будет калибровать. </li><li> Использование 10x объективом и светлого (BF) установки, определить положительное управления эмбриона и установить настройки экспозиции соответственно для BF и GFP каналов, убедившись, что сигнал флуоресценции не насыщая камеру. Сосредоточьтесь на одном эмбриона и запрограммировать микроскоп, чтобы приобрести 3 всего Z-секций, одно изображение 50 мкм выше и один 50 мкм ниже текущей фокальной плоскости. ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку различные ткани занимают разные фокальных плоскостей, это гарантирует, что для каждого данио изображения будут захвачены с сердца и печени в центре внимания. </li><li> Установите параметры программных приобрести выложены изображения с помощью GFP и BF каналлевая сторона На вкладке приобретения, выберите дополнительные настройки. Выбор регионов плитка, то плитка. Выберите опцию круг хорошо. ПРИМЕЧАНИЕ: Черепица используется для создания изображения каждой лунки. Одно поле-обзора захватывает только небольшую часть каждую лунку. Функция плитка может автоматически захватить несколько соседних полей-обзора из каждой лунки, создавая составное изображение всего скважины. Таким образом, можно автоматически захвата 96 составных изображений на тарелку, где каждый составное изображение содержит несколько десятков отдельных изображений из одной скважины. </li><li> Выберите носитель и коэффициент заполнения 90%. Выбор коэффициент заполнения 90% будет захватить несколько изображений выбранных скважин таких, что 90% площади каждой лунки будут видны в комбинированном изображении. ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе коэффициента заполнения, диаграмма будет отображаться представляющий область для включения в образ. Выберите процент, который будет включать в себя зону скважины, который подходит для эксперимента. </li><li> В разделе Параметры выберите величину перекрытия лучшего. ПРИМЕЧАНИЕ: При сшивая плитки для одного представительного изображения, перекрытие 5-10% обеспечивает плавный шов между изображениями. Однако, если изображение шить не является необходимым, используя 0% перекрытие сократит время обработки изображений. Использование 90% коэффициент заполнения и 5% перекрытие, составное изображение из одной скважины состоит из 59 отдельных изображений. </li><li> Начните изображений. Микроскоп автоматически получать изображения. </li><li> Вручную проверять составные изображения каждой лунки для тканеспецифической флуоресценции (рис. 1). </li><li> ПРИМЕЧАНИЕ: Это лучше всего начать с положительного контроля, чтобы убедиться, что химическое воздействие работал до наблюдения экспериментальных скважин лечения. </li></ol> 4. Руководство Image Capture эмбрионов в 96-луночный планшет ПРИМЕЧАНИЕ: Для подтверждения результатов следует использовать 20x длиннее расстояние цели в переменныйдесть более детальные изображения вручную (рис. 2). <ol><li> Использование 20x объективом и светлого (BF) установки, определить положительное управления эмбриона и установить настройки экспозиции для BF и GFP каналов соответственно, убедившись, что сигнал флуоресценции не насыщая камеру. </li><li> Определить индивидуальные эмбрионов и снимать вручную. ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как параметры экспозиции были отобраны, положительного контроля эмбриона, не изменить настройки. Это позволяет сравнение интенсивности флуоресценции как каждом снимке на единообразных условиях. </li></ol>

<ol>
	<li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens.">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).</li><li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish.">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li><li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish.">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li><li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+A+tool+for+chemical+screens.">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li><li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos.">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li><li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+reporter+quantification+in+vivo:+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish.">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+estrogen+response+element.">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li><li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation.">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book:+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , (2000).</li></ol>

Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Этот протокол описывает прямой метод, автоматически изображений тканеспецифичным флуоресценции у эмбрионов данио рерио. Протокол был разработан с использованием Zeiss Axio Observer. Z1 с дзен Синий 2011 программного обеспечения, однако методика может быть адаптирована с помощью любого инвертир...

Трансгенные данио были разработаны, которые позволяют прямой визуализации активности в пути, такие как роста фибробластов факторы 1, ретиноевой кислоты 2 и эстрогены 3, в живых эмбрионов сигнализации. Такие инструменты позволяют скрининг для химических веществ, которые возмущают сигнальных путей (анализировали, как изменение интенсивности флуоресценции) или химических веществ, которые модулируют сигнализации в ткане-специфическим образом (изменение локализации флуоресценции) 4. Автоматизированный ввод изображений увеличивает пропускную способность химических экранов резко 5,6. Экраны, которые автоматически анализа флуоресценции в живом рыбок данио часто полагаются на дорогой, специализированного оборудования. Так называемый скрининг высокого содержания обеспечивает преимущества высокого разрешения, количественного изображений, но за счет использования специализированных читателей пластины оборудованные для конфокальной микроскопии 7,8. Цель этого метода состоит в автоматическом анализе тканеспецифичным флуоресценции у эмбрионов данио рериов 96-луночный планшет с использованием стандартного эпифлюорисцентной микроскопа. Тканеспецифическая флуоресценции можно отличить с помощью этой техники и может быть разумным подходом для лабораторий, которые не имеют доступа к специализированным читателей пластины или высокой-контент оборудования для досмотра. В этом протоколе, мы используем автоматизированную изображений для обнаружения тканеспецифической рецептора эстрогена (ER) агонисты в живом рыбок данио в 3 дней после оплодотворения (DPF). Трансгенной линии Tg (5xERE: GFP) c262/c262 содержит 5 тандем реагирования эстрогена элементов последовательности ДНК (ЭРД) вверх по течению от зеленого флуоресцентного белка (GFP) 3. В отсутствие лиганда, ERS обычно неактивны. Связывание лиганда вызывает конформационные изменения, что позволяет рецепторы для связывания ERE ДНК и регулируют транскрипцию 9. 5xERE: GFP рыба может быть использован для скрининга химических библиотек для ER модуляторов и может быть использован для скрининга образцов окружающей воды для эстрогенных загрязнений.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:885px;" width="886">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:451px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; wide bore</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; fine tip</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well, round, flat bottom plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">21-377-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 x 35mm paltes</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 60mm plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dumont #5 fine forceps</td>
			<td style="width:100px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tricane methanesulfonate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040-25G</td>
			<td>see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629-10G</td>
			<td>Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 &#956;M in E3B&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20x long working distance objective</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiocam HRm digital camera</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ZenBlue 2011 microscope control software</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;MB-1; 25 grams</td>
			<td>make 2% solution in RO water for use in E3B (below)</td>
		</tr>
		<tr height="273">
			<td height="273" style="height:273px;">E3B</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">60X E3 SOLUTION: 
			NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 17.2 grams 
			KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.76 grams 
			CaCl2-2H2O&#160;&#160;&#160;&#160; - 2.9 grams 
			MgSO4-7H2O&#160; - 4.9 grams or MgSO4 &#8211; 2.39 grams 
			Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 
			 
			1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 
			60X E3&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 150mls 
			2% methylene blue&#160;&#160;&#160;&#160; 100&#956;l&#160; 
			Bring to 9 liters with Milli-Q water 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos

Эмбрионы рыбок данио являются мощным инструментом для крупномасштабного скрининга малых молекул. Трансгенные данио, которые выражают флуоресцентные репортер белки часто используются для выявления химических веществ, которые модулируют экспрессию генов. Химические экраны, которые анализа флуоресценции в живом рыбок данио часто полагаются на дорогой, специализированного оборудования для скрининга высокое содержание. Мы описываем процедуру с использованием стандартного эпифлюорисцентной микроскоп с моторизованным этапе для автоматической изображения эмбрионов данио рерио и выявления тканеспецифической флуоресценции. Использование трансгенных данио, что отчет о деятельности рецептора эстрогена через выражение GFP, мы разработали процедуру полуавтоматического для выявления рецептора эстрогена лигандов, активирующих репортеру в тканеспецифического образом. В этом видео мы описываем процедуры выстроив эмбрионов данио рерио в 24-48 часов после оплодотворения (ФВЧ) в 96-луночный планшет и добавляя небольшие молекулы, которые связывают рецепторы эстрогена. В 72-96 часов после оплодотворения, образы каждую лунку отвся пластина автоматически собираются и вручную проверять на тканеспецифической флуоресценции. Этот протокол демонстрирует способность обнаруживать эстрогены, которые активируют рецепторы в сердечных клапанов, но не в печени.

На рисунке 1 показана составных изображений из отдельных скважин 96-луночный планшет с. Каждый составное изображение состоит из 59 отдельных изображений с 5%-ым перекрытием изображения. Обратите внимание, что в прямом эфире данио ориентированы случайным образом в каждой лунке, н...

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos at JoVE.com

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Описанный здесь это протокол для полу-автоматизированной визуализации тканеспецифической флуоресценции у эмбрионов рыбок данио.

Полуавтоматическая изображений тканеспецифических флуоресценции у эмбрионов данио рерио

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

semi-automated-imaging-tissue-specific-fluorescence-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K Views.  University of Alabama at Birmingham.  Описанный здесь это протокол для полу-автоматизированной визуализации тканеспецифической флуоресценции у эмбрионов рыбок данио. 

Video: Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Микроинъекция мРНК и Олигонуклеотиды морфолино антисмысловых в данио рерио эмбрионов.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Двухфотонное axotomy и покадровой конфокальной микроскопии в живых эмбрионов данио рерио

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Полуавтоматическая оптического анализа Heartbeat малых сердца

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Покадровый Визуализация Митоз После трансфекции миРНК

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Два-Фотон основе Фотоактивация в Живом данио рерио Эмбрионы

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Трансплантация GFP-экспрессирующих бластомеров для живых изображений сетчатки и мозга развития в химерические эмбрионов данио рерио

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Изображениями сотовый изменения формы в живых Drosophila Эмбрионы

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Хроматин Иммунопреципитация Пробирной для тканеспецифические Гены использованием ранней стадии эмбрионы мыши

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Изображений гликанов в данио рерио Эмбрионы от метаболического Маркировка и Bioorthogonal химии нажмите

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Метаболический Анализ профиля эмбрионов данио рерио

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...