Damos las gracias a Susan Farmer y el personal del centro de investigación de la UAB pez cebra para el cuidado de pez cebra. Financiamiento proporcionado por los fondos de puesta en marcha del Departamento de Farmacología y Toxicología.

NOTA: Este protocolo fue aprobado por la Universidad de Alabama en Comité de Cuidado de Animales y el empleo Institucional Birmingham. 1. Cría de pez cebra y huevo Colecciones <ol><li> Tres días antes de comenzar la exposición a sustancias químicas, montar tanques de cría con separadores a hombres y mujeres por separado. Rellene cada mitad del tanque con agua del sistema de acuicultura. El uso de una red, transferencia de TG (5xERE: GFP) peces c262/c262 a los tanques de cría, la colocación de 2 machos y 3 hembras en cada tanque separados por un divisor. Coloque una tapa en cada tanque y la etiqueta con la fecha y cepas para ser cruzados. </li><li> A la mañana siguiente, eliminar todos los obstáculos e inclinación desconcierta para crear una zona de poca profundidad en un extremo del tanque de cría. Permita que el pez cebra para aparearse, recogiendo embriones a intervalos de 10 minutos para asegurar la puesta en escena del desarrollo preciso. Huevos limpios de enjuague a través de un colador de té utilizando medio E3B y embriones suavemente rasantes en placas de Petri. Volver a los peces adultos permanentetanques. </li><li> El uso de un microscopio de disección, clasificar, contar y eliminar cualquier embrión no fecundados, anormales o dañados. Coloque los embriones en placas de Petri en medio E3B y la casa de 28,5 ° C con una luz 14:10: oscuridad ciclo. Densidad de embriones puede afectar el desarrollo. Coloque no más de 100 embriones en una placa de 100 mm x 35 y no más de 50 embriones en una placa de 60 mm x 15. </li><li> Por 24 HPF, sustitución de los medios con E3B contiene 200 M 1-fenil-2 tiourea (PTU). PTU impide la formación de pigmento y mantiene embriones de pez cebra y larvas transparentes para mejorar la claridad de la imagen. PRECAUCIÓN: concentrado PTU valores es peligroso; usar guantes al realizar solución E3B + PTU. </li><li> A después de la fecundación de 1 día (dpf), quite manualmente el corion de cada embrión utilizando unas pinzas finas. El corion no parece afectar a la penetración de los estrógenos, sin embargo la eliminación mejora la claridad de la imagen. No hay necesidad de eliminar chorions de los medios de comunicación. NOTA: Como alternativa a dechorionation manual, lotes de embriones pueden ser chemicamente dechorionated utilizando 1 mg / ml de pronasa tratamiento, como se ha descrito previamente 11. </li></ol> 2. Tratamiento Químico de Embriones <ol><li> El día antes del tratamiento, preparar soluciones madre de cada producto químico a una concentración 1.000 veces en DMSO (o disolvente apropiado). Por ejemplo, para exponer los embriones a 10 M bisfenol A (BPA), preparar una solución de 10 mM de BPA en 100% de DMSO. Esto asegura concentración de DMSO en cada tratamiento uniforme y permite una dilución 1:1000 no tóxico de DMSO para servir como un control del vehículo. Soluciones de tienda de existencias a -20 ° C. Para este protocolo, los embriones estarán expuestos a 1 M y 10 M de BPA, 18,5 nM y 1,85 M genisteína, 367 nM de estradiol (control positivo) y el vehículo (0,1% de DMSO, control negativo). PRECAUCIÓN: Los productos químicos como BPA y estradiol son peligrosos y pueden tener efectos nocivos sobre el feto humano. Maneje los disruptores endocrinos con cuidado y use siempre el equipo de protección personal adecuado.</li><li> En el día del tratamiento, deshielo prepara soluciones químicas de las acciones. Diluir 1:1.000 con la pipeta 1 ml E3B + PTU en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añadir 1 l de solución madre química. Vortex vigorosamente. Diluir DMSO 1:1.000 en E3B + PTU como un control del vehículo. Utilice 1 ml E3B + PTU en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml como control no tratado. </li><li> El uso de un gran pipeta de transferencia de plástico orificio, embriones de transferencia de placas de Petri en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, 3 embriones por pocillo, 3 pocillos por condición. Para evitar la evaporación durante el tratamiento prolongado, omita los embriones de filas y columnas exteriores de la placa (filas A y E, columnas 1 y 12). Pocillos externos se pueden llenar con 300 l de E3B + PTU. Etiquetar la tapa placa adecuada. </li><li> Retire el medio de cada pocillo con una pipeta de transferencia de plástico de punta fina. Trabaje con rapidez para evitar la desecación de los embriones. </li><li> Añadir 200 l de solución de tratamiento en pocillo correspondiente. Coloque la tapa underneath la placa como una guía para asegurar Además de los tratamientos en los pocillos apropiados. Vortex cada tubo antes de dispensar para distribuir el producto químico en solución. Confirmar visualmente cada embrión es en la solución de tratamiento. Si los embriones están en el lado del pozo, utilizar una pipeta de transferencia limpia para lavarlos en el pozo con la solución de tratamiento. </li><li> Colocar la placa en la incubadora a 28,5 ° C. Se analizarán los embriones de fluorescencia a 72 HPF. </li></ol> 3. Automated Imaging de embriones en placas de 96 pocillos <ol><li> Anestesie embriones mediante la adición de 10 l de 4 mg / ml de tricaína a cada pocillo. NOTA: Anestesie embriones antes de la formación de imágenes. En 24-96 HPF, el pez cebra exhiben movimiento espontáneo y una respuesta de sobresalto a la fuente de luz cambia durante la captura de imágenes. Anestesiar embriones reduce el movimiento durante el procedimiento. </li><li> Coloque la placa de 96 pocillos en la etapa motorizada y calibrar la etapa. Usando Zeiss Zen Azul 2011 software para automáticamente microscopíaencendido y de control, seleccione la opción de soporte de muestras y seleccione multiwell 96. Seleccione Calibrar. Siga las instrucciones paso a paso para calibrar el escenario. NOTA: No desactive el botón de azulejos después de este paso. Si el botón de azulejos está seleccionada, los ajustes de calibración se pueden perder y necesitarán la placa de 96 pocillos ser recalibrado. </li><li> Utilizando un objetivo de 10x y el campo claro (BF) establecer, identificar un embrión de control positivo y establecer los ajustes de exposición apropiadamente para BF y canales de GFP, asegurándose de que la señal de fluorescencia no está saturando la cámara. Centrarse en un solo embrión y programar el microscopio para adquirir 3 Z-secciones en total, una imagen de 50 m por encima y otro por debajo de 50 micras el plano focal actual. NOTA: Debido a los diferentes tejidos ocupan diferentes planos focales, esto asegurará que se capturan para cada imagen de pez cebra con el corazón y el hígado en el enfoque. </li><li> Establezca los parámetros de software para adquirir una imagen de mosaico utilizando GFP y BF channels. En la pestaña de adquisición, seleccionar Configuración avanzada. Seleccione las regiones de azulejos, a continuación, azulejos. Elija la opción círculo también. NOTA: baldosas se utiliza para crear una imagen compuesta de cada pocillo. Un campo de visión de un solo capta sólo una pequeña porción de cada pocillo. La función de mosaico puede capturar de forma automática múltiples adyacentes campos de visión de cada pozo, creando una imagen compuesta de todo el pozo. Por lo tanto, es posible capturar automáticamente 96 imágenes compuestas por placa, donde cada imagen compuesta contiene varias docenas de imágenes individuales de un solo pozo. </li><li> Seleccione la compañía y el factor de llenado del 90%. Selección de un factor de llenado de 90% será capturar múltiples imágenes de los pocillos seleccionados tal que el 90% de la superficie de cada pocillo será visible en la imagen compuesta. NOTA: Al seleccionar factor de relleno, un diagrama se muestra que representa el área a explorar. Seleccione un porcentaje que incluirá el área del pozoque es apropiado para el experimento. </li><li> En Opciones, seleccione la cantidad de superposición deseado. NOTA: Cuando la costura de azulejos para una sola imagen representativa, una superposición de 5 a 10% permite una costura lisa entre las imágenes. Sin embargo, si la imagen de costura es innecesaria, utilizando un solapamiento de 0% reducirá el tiempo de formación de imágenes. El uso de 90% de factor de relleno y 5% de superposición, una imagen compuesta de un solo pozo consta de 59 imágenes individuales. </li><li> Iniciar la formación de imágenes. El microscopio adquirirá automáticamente las imágenes. </li><li> Inspeccionar manualmente las imágenes compuestas de cada pocillo para la fluorescencia específico de tejido (Figura 1). </li><li> NOTA: Es mejor comenzar con el control positivo para confirmar que la exposición química trabajó antes de la observación de los pozos de tratamiento experimental. </li></ol> 4. Manual Image Capture de embriones de 96 pocillos Placa NOTA: Para confirmar los resultados, utilice un objetivo de 20x larga distancia de trabajo de acqui si las imágenes más detalladas manualmente (Figura 2). <ol><li> Usando un objetivo de 20x y el campo claro (BF) establecer, identificar un embrión de control positivo y establecer los ajustes de exposición para los canales de BF y GFP adecuadamente, asegurándose de que la señal de fluorescencia no está saturando la cámara. </li><li> Identificar embriones individuales y capturar imágenes de forma manual. NOTA: Una vez que los ajustes de la exposición han sido seleccionadas por el embrión de control positivo, no modifique los ajustes. Esto permite una comparación de la intensidad de fluorescencia a medida que cada imagen se captura en condiciones uniformes. </li></ol>

<ol>
	<li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens.">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).</li><li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish.">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li><li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish.">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li><li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+A+tool+for+chemical+screens.">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li><li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos.">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li><li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+reporter+quantification+in+vivo:+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish.">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+estrogen+response+element.">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li><li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation.">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book:+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , (2000).</li></ol>

Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

Este protocolo describe un método directo para automáticamente una imagen de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra. El protocolo fue desarrollado utilizando un Zeiss Axio Observer. Z1 con el software de Zen Azul 2011, sin embargo, la técnica se puede adaptar usando cualquier microscopio invertido con una platina motorizada y software de control de microscopio que puede realizar suelo de baldosas para crear imágenes compuestas. Equipar a un microscopio invertido con una platina motorizada pued...

Pez cebra transgénico se han desarrollado que permite la visualización directa de la actividad en las vías de señalización, tales como factores de crecimiento de fibroblastos 1, el ácido retinoico 2 y 3 estrógenos, en embriones vivos. Estas herramientas permiten la detección de productos químicos que perturban las vías de señalización (ensayada como el cambio en la intensidad de fluorescencia) o para los productos químicos que modulan la señalización de una manera específica de tejido (el cambio en la localización de la fluorescencia) 4. Captura de imagen automatizada aumenta el rendimiento de las pantallas químicas dramáticamente 5,6. Pantallas que la fluorescencia de ensayo de forma automática en el pez cebra en vivo a menudo dependen de un equipo caro y especializado. La llamada de cribado de alto contenido proporciona el beneficio de alta resolución, formación de imágenes cuantitativo pero a costa de la utilización de lectores de placas especializadas equipadas para microscopía confocal 7,8. El objetivo de este método es automáticamente ensayo de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebraen una placa de 96 pocillos usando un microscopio de epifluorescencia estándar. La fluorescencia específica del tejido se puede distinguir usando esta técnica y puede ser un enfoque razonable para los laboratorios que no tienen acceso a lectores de placas o equipos especializados-alto contenido de cribado. En este protocolo, utilizamos imágenes automatizado para detectar los receptores de estrógenos específico de tejido (ER) agonistas en el pez cebra en vivo en 3 días después de la fertilización (dpf). La línea transgénica Tg (5xERE: GFP) c262/c262 contiene 5 secuencias en tándem de respuesta de estrógeno de elementos de ADN (ERE) aguas arriba de la proteína verde fluorescente (GFP) 3. En ausencia de ligando, el ERS son normalmente inactivo. La unión del ligando provoca un cambio conformacional, permitiendo que los receptores de unirse al ADN y regulan la transcripción ERE 9. 5xERE: peces GFP se pueden utilizar para cribar bibliotecas químicas para moduladores de ER y se pueden utilizar para cribar muestras de agua ambiental para los contaminantes estrogénicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:885px;" width="886">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:451px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; wide bore</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; fine tip</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well, round, flat bottom plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">21-377-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 x 35mm paltes</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 60mm plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dumont #5 fine forceps</td>
			<td style="width:100px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tricane methanesulfonate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040-25G</td>
			<td>see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629-10G</td>
			<td>Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 &#956;M in E3B&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20x long working distance objective</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiocam HRm digital camera</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ZenBlue 2011 microscope control software</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;MB-1; 25 grams</td>
			<td>make 2% solution in RO water for use in E3B (below)</td>
		</tr>
		<tr height="273">
			<td height="273" style="height:273px;">E3B</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">60X E3 SOLUTION: 
			NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 17.2 grams 
			KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.76 grams 
			CaCl2-2H2O&#160;&#160;&#160;&#160; - 2.9 grams 
			MgSO4-7H2O&#160; - 4.9 grams or MgSO4 &#8211; 2.39 grams 
			Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 
			 
			1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 
			60X E3&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 150mls 
			2% methylene blue&#160;&#160;&#160;&#160; 100&#956;l&#160; 
			Bring to 9 liters with Milli-Q water 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos

Embriones de pez cebra son una poderosa herramienta para el cribado a gran escala de las moléculas pequeñas. Pez cebra transgénico que expresan proteínas fluorescentes reportero se utilizan con frecuencia para identificar productos químicos que modulan la expresión génica. Pantallas químicas que ensayo de fluorescencia en el pez cebra en vivo a menudo dependen de un equipo costoso, especializado para el cribado de alto contenido. Se describe un procedimiento utilizando un microscopio de epifluorescencia estándar con una platina motorizada a la imagen automáticamente embriones de pez cebra y detectar la fluorescencia específica del tejido. El uso de pez cebra transgénico que reportan la actividad del receptor de estrógeno a través de la expresión de GFP, hemos desarrollado un procedimiento semi-automático para la detección de ligandos del receptor de estrógeno que activan el reportero en una manera específica de tejido. En este video se describen los procedimientos para poner en orden embriones de pez cebra a las 24-48 horas después de la fecundación (HPF) en una placa de 96 pocillos y la adición de pequeñas moléculas que se unen a receptores de estrógeno. En 72-96 HPF, las imágenes de cada pocillo detoda la placa se recogen de forma automática y la inspección manual de la fluorescencia específica del tejido. Este protocolo demuestra la capacidad para detectar los estrógenos que activan los receptores en las válvulas del corazón, pero no en el hígado.

La Figura 1 muestra imágenes compuestas a partir de pocillos individuales de una placa de 96 pocillos. Cada imagen compuesta se compone de 59 imágenes individuales con 5% imagen de superposición. Tenga en cuenta que el pez cebra en vivo están orientadas aleatoriamente dentro de cada pocillo, sin embargo, son capaces de distinguir la fluorescencia en el corazón desde el hígado. Imágenes de campo claro son útiles como referencias para evaluar la orientación del pez cebra y visualizar anormalidade...

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Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Descrito aquí es un protocolo para la formación de imágenes semiautomático de la fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra.

Imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

semi-automated-imaging-tissue-specific-fluorescence-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K vistas.  University of Alabama at Birmingham.  Descrito aquí es un protocolo para la formación de imágenes semiautomático de la fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra. 

Video: Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Investigación

Biología

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Semi-automatizado de análisis óptico latido de los corazones pequeños

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

De dos fotones basado en fotoactivación en vivo embriones de pez cebra

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

El trasplante de las buenas prácticas agrarias-que expresa Blastómeros de imágenes en vivo del desarrollo de la retina y el cerebro en embriones de pez cebra quiméricos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Celular imagen Cambiar forma de vida Drosophila Los embriones

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina de los genes específicos de tejido utilizando etapa temprana de embriones de ratón

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Glicanos imágenes en embriones de pez cebra mediante marcado metabólico y Química Haga clic Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Análisis del perfil metabólico de embriones de pez cebra

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...