نشكر سوزان المزارعين وموظفي البنك العربي المتحد الزرد مرفق البحوث لرعاية الزرد. التمويل التي تقدمها صناديق بدء من قسم علم الأدوية والسموم.

ملاحظة: تمت الموافقة على هذا البروتوكول من جامعة ألاباما في جنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية برمنغهام. 1. تربية اسماك الزرد ومجموعات البيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل ثلاثة أيام من بداية التعرض للمواد الكيميائية وتجميع الدبابات تربية مع فواصل للذكور والإناث منفصلة. ملء كل منتصف الطريق خزان المياه مع نظام تربية الأحياء المائية. باستخدام صافي، ونقل تيراغرام (5xERE: GFP) الأسماك c262/c262 إلى خزانات تربية، ووضع 2 ذكور و 3 إناث في كل خزان مفصولة المفرق. وضع غطاء على كل خزان وتسمية مع التاريخ والسلالات إلى أن عبروا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي، وإزالة كافة الحواجز والميل يحير لإنشاء منطقة ضحلة في نهاية واحدة من خزان التربية. السماح الزرد لزميله، وجمع الأجنة في 10 دقيقة فترات لضمان انطلاق التنموية دقيقة. البيض نظيفة من قبل الشطف من خلال مصفاة الشاي باستخدام E3B المتوسطة والأجنة تدفق برفق في أطباق بتري. العودة الأسماك البالغة لدائمةالدبابات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر تشريح والفرز والعد، وإزالة أي أجنة غير مخصبة، والشاذ أو التالفة. المكان الأجنة في أطباق بتري في E3B المتوسطة ومنزل في 28.5 درجة مئوية مع ضوء 14:10: دورة الظلام. كثافة الجنين يمكن أن تؤثر على التنمية. وضع ما لا يزيد عن 100 ملم الأجنة في صحن 100 × 35 و لا يزيد عن 50 الأجنة في 60 × 15 مم طبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بنسبة 24 HPF، استبدال وسائل الإعلام مع E3B تحتوي على 200 ميكرومتر 1-2-فينيل ثيويوريا (PTU). PTU يمنع تشكيل الصباغ ويحافظ الأجنة الزرد واليرقات شفافة لتحسين وضوح الصورة. تنبيه: الأسهم PTU تتركز خطرة؛ ارتداء القفازات عند اتخاذ الحل E3B + PTU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الإخصاب آخر 1 يوم (DPF)، يدويا إزالة المشيماء من كل جنين باستخدام ملقط غرامة. لا يظهر المشيماء أن تؤثر تغلغل هرمون الاستروجين، ولكن إزالة يعزز وضوح الصورة. ليست هناك حاجة لإزالة chorions من وسائل الإعلام. ملاحظة: كبديل لdechorionation دليل، دفعات من الأجنة يمكن تشيdechorionated mically باستخدام 1 ملغ / مل pronase العلاج، كما هو موضح سابقا 11. </li></ol> 2. العلاج الكيميائي للأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم قبل العلاج، وإعداد الحلول الأسهم من كل مادة كيميائية في تركيز 1،000 أضعاف في DMSO (أو المذيبات المناسبة). على سبيل المثال، لفضح الأجنة إلى 10 ميكرومتر ثنائي الفينول أ (BPA)، وإعداد محلول المخزون 10 ملي BPA في 100٪ DMSO. وهذا يضمن تركيز DMSO موحدة في كل معاملة ويسمح للغير سامة 1:1،000 التخفيف من DMSO لتكون بمثابة السيطرة على السيارة. حلول تخزين السهم عند -20 درجة مئوية. لهذا البروتوكول، سوف يتعرض الأجنة إلى 1 ميكرومتر و 10 ميكرومتر BPA، نانومتر 18.5 و 1.85 ميكرومتر الجينيستين، 367 نانومتر استراديول (مراقبة إيجابية) وسيارة (0.1٪ DMSO، ومراقبة سلبية). تنبيه: المواد الكيميائية مثل BPA واستراديول هي خطرة ويمكن أن يكون لها آثار ضارة على الجنين البشري. معالجة اختلال الغدد الصماء مع الرعاية ودائما استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من العلاج، أعدت ذوبان المحاليل الكيميائية الأسهم. تمييع 1:1،000 بواسطة pipetting 1 مل + E3B PTU في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وإضافة 1 ميكرولتر من محلول المخزون الكيميائية. دوامة بقوة. تمييع DMSO 1:1،000 في E3B + PTU بمثابة السيطرة على السيارة. استخدام 1 مل + E3B PTU في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل كعنصر تحكم غير المعالجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة كبيرة تتحمل نقل البلاستيك، ونقل الأجنة من أطباق بتري في كل بئر من لوحة 96 جيدا، 3 أجنة لكل بئر، 3 آبار في الشرط. لمنع التبخر خلال فترة العلاج لفترات طويلة، حذفت الأجنة من الصفوف والأعمدة الخارجي من لوحة (الصفوف A و E، والأعمدة 1 و 12). يمكن ملء الآبار الخارجي مع 300 ميكرولتر من E3B + PTU. تسمية لوحة غطاء مناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام من كل بئر مع غرامة يميل نقل البلاستيك ماصة. العمل بسرعة لتجنب جفاف الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من محلول معالجة في المقابلة أيضا. وضع غطاء underneath لوحة كدليل لضمان إضافة العلاجات المناسبة في الآبار. دوامة كل أنبوب قبل pipetting لتوزيع هذه المادة الكيميائية في المحلول. تأكيد بصريا كل جنين في الحل العلاج. إذا الأجنة على جانب البئر، واستخدام الماصة نقل نظيفة لغسلها في البئر مع الحل العلاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في الحاضنة في 28.5 درجة مئوية. وسيتم تحليل الأجنة لمضان في 72 HPF. </li></ol> 3. التصوير الآلي من الأجنة في لوحات 96 جيد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الأجنة عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 4 ملغ / مل تريكين إلى كل بئر. ملاحظة: تخدير الأجنة قبل التصوير. في 24-96 HPF، الزرد يحمل حركة عفوية وردود الفعل المفاجئة لمصدر الضوء المتغيرة أثناء التقاط الصور. التخدير الأجنة يقلل من الحركة أثناء التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة 96 جيدا في مرحلة الآلية ومعايرة المرحلة. باستخدام زايس زن الأزرق 2011 برنامج للفحص المجهري ومحوالسيطرة على، حدد الخيار الناقل العينة وتحديد multiwell 96. اختر معايرة. اتبع الإرشادات خطوة بخطوة لمعايرة المرحلة. ملاحظة: لا إلغاء الزر البلاط بعد هذه الخطوة. إذا كان الزر البلاط غير محددة، قد يتم فقدان إعدادات المعايرة وسيتعين على لوحة 96 جيدا أن تعديلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الهدف 10X وbrightfield (BF) وضع وتحديد الجنين مراقبة إيجابية وتعيين إعدادات التعرض بشكل مناسب لBF وقنوات GFP، والتأكد من أن إشارة مضان لا تشبع الكاميرا. التركيز على الجنين واحد وبرنامج المجهر للحصول على إجمالي 3 Z-أقسام وصورة واحدة 50 ميكرون أعلاه واحدة 50 ميكرومتر تحت البؤري الحالي. ملاحظة: نظرا لأن أنسجة مختلفة تشغل طائرات التنسيق المختلفة، وهذا سوف يضمن ليتم التقاط كل الصور الزرد مع القلب والكبد في التركيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين المعلمات البرمجيات للحصول على صورة من البلاط باستخدام GFP وBF CHANNEليرة سورية. تحت علامة التبويب الاستحواذ، حدد الإعداد المتقدمة. حدد المناطق البلاط، ثم البلاط. اختر الخيار الدائرة أيضا. ملاحظة: يتم استخدام التبليط لخلق صورة مركب من كل بئر. وجهة نظر ميدانية من واحد يلتقط سوى جزء صغير من كل بئر. وظيفة تبليط يمكن التقاط تلقائيا متعددة الحقول المتاخمة للرؤية من كل جانب، وخلق صورة مركبة من البئر بأكمله. وبالتالي فإنه من الممكن التقاط الصور تلقائيا 96 مركب في لوحة، حيث يحتوي كل صورة مركب عشرات الصور الفردية من بئر واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الناقل وملء عامل 90٪. واختيار عامل تعبئة 90٪ من التقاط صور متعددة من آبار مختارة مثل التي من شأنها أن 90٪ من مساحة كل بئر تكون مرئية في الصورة المركبة. ملاحظة: عند اختيار عامل تعبئة، سيتم عرض رسم بياني يمثل المنطقة المراد تصويرها. تحديد النسبة التي سوف تشمل منطقة البئرغير مناسبة للتجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمن خيارات، حدد مقدار التداخل المطلوب. ملاحظة: عند ترقيع البلاط للحصول على صورة ممثل واحد، تداخل من 5-10٪ يسمح لالتماس السلس بين الصور. ومع ذلك، إذا الصورة خياطة لا لزوم لها، وذلك باستخدام التداخل 0٪ سوف يقلل وقت التصوير. باستخدام 90٪ عامل تعبئة و 5٪ التداخل، صورة مركبة من بئر واحد يتكون من 59 الصور الفردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء التصوير. سوف المجهر الحصول على صور تلقائيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفقد الصور مركب من كل بئر لمضان الأنسجة محددة (الشكل 1) يدويا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة: فمن الأفضل أن تبدأ مع مراقبة إيجابية للتأكد من أن التعرض للمواد الكيميائية عملت قبل مراقبة الآبار العلاج التجريبي. </li></ol> 4. دليل التقاط الصور من الأجنة في 96 لوحة جيدا ملاحظة: لتأكيد النتائج، استخدم الهدف 20X مسافة العمل الطويلة لميلانكراس الصور أكثر تفصيلا يدويا (الشكل 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الهدف 20X وbrightfield (BF) وضع وتحديد الجنين مراقبة إيجابية وتعيين إعدادات التعرض للقنوات BF وGFP بشكل مناسب، والتأكد من أن إشارة مضان لا تشبع الكاميرا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الأجنة الفردية والتقاط الصور يدويا. ملاحظة: مرة واحدة وقد تم اختيار إعدادات التعرض لالجنين مراقبة إيجابية، لا تغير من الإعدادات. هذا يسمح للمقارنة بين كثافة مضان كما يتم التقاط كل صورة في ظل ظروف موحدة. </li></ol>

<ol>
	<li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens.">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).</li><li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish.">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li><li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish.">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li><li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+A+tool+for+chemical+screens.">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li><li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos.">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li><li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+reporter+quantification+in+vivo:+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish.">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+estrogen+response+element.">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li><li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation.">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book:+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , (2000).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

يصف هذا البروتوكول وسيلة مباشرة لتلقائيا صورة مضان الأنسجة محددة في الأجنة الزرد. وقد تم تطوير بروتوكول باستخدام زايس محوري المراقب. Z1 مع زن الأزرق 2011 برنامج، ولكن هذه التقنية يمكن تكييفها باستخدام أي مجهر مقلوب مع مرحلة الآلية وبرامج التحكم المجهر التي يمكن أن تؤدي...

وقد وضعت الزرد المعدلة وراثيا التي تسمح لرؤية مباشرة من النشاط في مسارات الإشارات، مثل عوامل نمو الخلايا الليفية 1، حمض الريتينويك 2 و 3 الاستروجين، في الأجنة الحية. هذه الأدوات تمكين الكشف عن المواد الكيميائية التي التشويش على مسارات إشارات (يعاير مثل تغير في كثافة مضان) أو المواد الكيميائية التي تعدل يشير بطريقة الأنسجة محددة (تغيير في مضان التعريب) 4. التقاط الصور الآلي يزيد من الإنتاجية بشكل كبير من شاشات الكيميائية 5،6. الشاشات التي مضان فحص تلقائيا في الزرد يعيش غالبا ما تعتمد على تكلفة، والمعدات المتخصصة. يوفر ما يسمى الفرز الفائق محتوى صالح ارتفاع القرار، والتصوير الكمي ولكن على حساب من استخدام لوحة القراء المتخصصة المجهزة لالمجهري متحد البؤر 7،8. الهدف من هذا الأسلوب هو تلقائيا مقايسة مضان الأنسجة محددة في الأجنة الزردفي لوحة 96 جيدا باستخدام مجهر epifluorescence القياسية. ويمكن تمييز مضان الأنسجة محددة باستخدام هذه التقنية، وربما يكون نهجا معقولا للمختبرات التي تفتقر إلى الوصول إلى القراء لوحة المتخصصة أو معدات الفحص العالية المحتوى. في هذا البروتوكول، ونحن نستخدم التصوير الآلي للكشف عن الأنسجة محددة مستقبلات هرمون الاستروجين (ER) منبهات في الزرد حية في 3 أيام بعد الإخصاب (DPF). خط المعدلة وراثيا تيراغرام (5xERE: GFP) c262/c262 يحتوي على 5 جنبا إلى جنب استجابة هرمون الاستروجين تسلسل الحمض النووي عنصر (موسوعة الدين و الأخلاق) المنبع من البروتين الفلورية الخضراء (GFP) 3. في غياب يجند، المتطلبات البيئية عادة ما تكون غير نشطة. يجند ملزم يتسبب في تغيير متعلق بتكوين جزئي، مما يسمح للمستقبلات لربط ااا الحمض النووي وتنظيم النسخ 9. 5xERE: الأسماك GFP يمكن استخدامها لفحص المكتبات الكيميائية لجهري ER، ويمكن استخدامها لفحص عينات المياه للملوثات البيئية استروجين.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:885px;" width="886">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:451px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; wide bore</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; fine tip</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well, round, flat bottom plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">21-377-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 x 35mm paltes</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 60mm plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dumont #5 fine forceps</td>
			<td style="width:100px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tricane methanesulfonate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040-25G</td>
			<td>see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629-10G</td>
			<td>Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 &#956;M in E3B&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20x long working distance objective</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiocam HRm digital camera</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ZenBlue 2011 microscope control software</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;MB-1; 25 grams</td>
			<td>make 2% solution in RO water for use in E3B (below)</td>
		</tr>
		<tr height="273">
			<td height="273" style="height:273px;">E3B</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">60X E3 SOLUTION: 
			NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 17.2 grams 
			KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.76 grams 
			CaCl2-2H2O&#160;&#160;&#160;&#160; - 2.9 grams 
			MgSO4-7H2O&#160; - 4.9 grams or MgSO4 &#8211; 2.39 grams 
			Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 
			 
			1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 
			60X E3&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 150mls 
			2% methylene blue&#160;&#160;&#160;&#160; 100&#956;l&#160; 
			Bring to 9 liters with Milli-Q water 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos

الأجنة الزرد هي أداة قوية لفحص واسعة النطاق من جزيئات صغيرة. وكثيرا ما تستخدم الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية مراسل لتحديد المواد الكيميائية التي تعدل التعبير الجيني. شاشات الكيميائية التي مقايسة مضان في الزرد يعيش غالبا ما تعتمد على تكلفة، والمعدات المتخصصة لفحص نسبة عالية. نحن تصف الإجراء باستخدام المجهر epifluorescence معيار مع مرحلة الآلية تلقائيا صورة الأجنة الزرد وكشف مضان الأنسجة محددة. باستخدام الزرد المعدلة وراثيا التي تبلغ عن نشاط مستقبلات هرمون الاستروجين عن طريق التعبير عن GFP، وضعنا الداخلي شبه الآلي للكشف عن بروابط مستقبلات هرمون الاستروجين التي تنشط مراسل بطريقة الأنسجة محددة. في هذا الفيديو وصفنا إجراءات arraying الأجنة الزرد في 24-48 ساعة بعد الإخصاب (HPF) في لوحة 96 جيدا وإضافة جزيئات صغيرة التي تربط مستقبلات الاستروجين. في 72-96 HPF والصور من كل بئر منيتم جمع لوحة بأكمله تلقائيا وتفتيشها يدويا لمضان الأنسجة محددة. يوضح هذا البروتوكول القدرة على اكتشاف هرمون الاستروجين التي تنشط المستقبلات في صمامات القلب ولكن ليس في الكبد.

ويبين الشكل 1 الصور المركبة من الآبار الفردية لوحة 96 جيدا. وتتكون كل صورة مركب من 59 الصور الفردية مع 5٪ صورة التداخل. لاحظ أن الزرد الحية موجهة عشوائيا داخل كل بئر، ولكن نحن قادرون على التمييز مضان في قلب من الكبد. الصور Brightfield مفيدة كمرجع لتقييم التوجه الزرد و?...

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos at JoVE.com

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

الموصوفة هنا هو بروتوكول للتصوير شبه الآلي من مضان الأنسجة محددة في الأجنة الزرد.

التصوير الآلي شبه الإسفار من الأنسجة محددة في الزرد الأجنة

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

semi-automated-imaging-tissue-specific-fluorescence-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K Views.  University of Alabama at Birmingham.  الموصوفة هنا هو بروتوكول للتصوير شبه الآلي من مضان الأنسجة محددة في الأجنة الزرد. 

Video: Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

ثنائي الفوتون axotomy والوقت الفاصل بين التصوير مبائر يعيش في الأجنة الزرد

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

شبه الآلي التحليل البصري نبضات القلوب الصغيرة

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

ثنائي الفوتون المستندة إلى تنشيط ضوئي في الأجنة الحية اسماك الزرد

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

زرع GFP - معربا عن Blastomeres للتصوير لايف التنمية الشبكية والدماغ في الجنين اسماك الزرد همي

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

التصوير تغيير الشكل في الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأجنة

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

مناعي لونين الفحص الجينات الأنسجة الخاصة باستخدام أجنة فئران في مرحلة مبكرة

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Glycans التصوير في الأجنة التي وصفها اسماك الزرد الاستقلابية والكيمياء Bioorthogonal انقر

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

الأيض تحليل الملف من الأجنة الزرد

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...