Agradecemos Susan Farmer e os funcionários do centro de pesquisa do peixe-zebra UAB para cuidado zebrafish. O financiamento é fornecido pelos fundos de start-up do Departamento de Farmacologia e Toxicologia.

NOTA: Este protocolo foi aprovado pela Universidade de Alabama em Comitê Animal Care e Use Institucional Birmingham. 1. Breeding Zebrafish e ovo Coleções <ol><li> Três dias antes do início da exposição a produtos químicos, montar tanques de criação com divisórias para machos e fêmeas separados. Encha cada metade do caminho tanque com água do sistema de aquicultura. Usando uma rede, transferir Tg (5xERE: GFP) peixe c262/c262 para tanques de criação, colocando 2 machos e 3 fêmeas em cada tanque separado por uma divisória. Coloque uma tampa em cada tanque e etiqueta com data e as tensões a serem cruzados. </li><li> Na manhã seguinte, retire todas as barreiras e inclinação defletores para criar uma área rasa em uma extremidade do tanque de criação. Permitir peixe-zebra para acasalar, a coleta de embriões em intervalos de 10 min para garantir a encenação de desenvolvimento precisa. Ovos limpos lavando através de um coador de chá usando E3B médio e lave delicadamente embriões em placas de Petri. Retornar peixes adultos para permanentetanques. </li><li> Usando um microscópio de dissecação, classificar, contar, e remover todos os embriões não fertilizados, anormais ou danificados. Coloque embriões em placas de Petri em E3B médio e casa de 28,5 ° C, com 14:10 de luz: ciclo de escuro. Densidade de embriões pode afetar o desenvolvimento. Coloque no máximo 100 embriões em um prato de 100 mm x 35 e não mais de 50 embriões em um prato mm 60 x 15. </li><li> Por 24 hpf, substituir a mídia com E3B contendo 200 mM 1-fenil-2-tiouréia (PTU). PTU evita a formação de pigmento e mantém embriões de peixes-zebra e larvas transparente para melhorar a nitidez da imagem. CUIDADO: estoque PTU concentrado é perigoso; usar luvas ao fazer solução E3B + PTU. </li><li> Em 1 º dia pós fertilização (dpf), remover manualmente o córion de cada embrião usando uma pinça fina. O córion não parece afetar a penetração de estrogênios, porém remoção aumenta a nitidez da imagem. Não há necessidade de remover córions da mídia. NOTA: Como alternativa ao dechorionation manual, lotes de embriões pode ser checamente dechorionated utilizando 1 mg / mL de pronase de tratamento, como anteriormente descrito 11. </li></ol> 2. Química Tratamento de embriões <ol><li> No dia antes do tratamento, preparam-se soluções de estoque de cada produto químico, na concentração de 1000 vezes em DMSO (ou num solvente adequado). Por exemplo, para expor os embriões a 10 uM de bisfenol A (BPA), preparar uma solução de estoque 10 mM de BPA em 100% de DMSO. Isto assegura a concentração de DMSO uniforme em cada tratamento e permite uma diluição 1:1.000 não-tóxico de DMSO para servir como um controlo do veículo. As soluções de armazenar a -20 ° C. Para este protocolo, os embriões serão expostos a 1 uM e 10 uM de BPA, 18,5 nM e 1,85 uM de genisteína, 367 nM de estradiol (controlo positivo) e veículo (DMSO a 0,1%, de controlo negativo). ATENÇÃO: Produtos químicos, como BPA e estradiol são perigosos e podem ter efeitos deletérios sobre o feto humano. Lidar com disruptores endócrinos com cuidado e use sempre equipamento de protecção individual adequado.</li><li> No dia do tratamento, descongele preparadas soluções químicas de ações. Dilui-se 1:1000 pipetando 1 ml + E3B PTU para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e a adição de 1 ml de solução de estoque de produtos químicos. Vortex vigorosamente. Dilui-se 1:1000 em DMSO + E3B PTU como um controlo do veículo. Use 1 mL + E3B PTU num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, como um controlo não tratado. </li><li> Usando uma pipeta de transferência de plástico grande furo, embriões de transferência a partir de placas de Petri para cada poço de uma placa de 96 poços, 3 embriões por poço, 3 poços por condição. Para evitar a evaporação durante o tratamento prolongado, omitir embriões de linhas exteriores e as colunas da placa (linhas A e E, as colunas 1 e 12). Poços exteriores podem ser preenchidos com 300 ul de E3B + PTU. Rotular a tampa da placa de forma adequada. </li><li> Remova a mídia de cada poço com uma fina ponta da pipeta de transferência de plástico. Trabalhe rapidamente para evitar a secagem dos embriões. </li><li> Adicionar 200 ul de solução de tratamento em cavidade correspondente. Coloque a tampa underneath a placa como um guia para assegurar a adição de tratamentos para os poços apropriados. Vortex cada tubo antes da pipetagem para distribuir o produto químico em solução. Confirmar visualmente cada embrião é na solução de tratamento. Se os embriões estão do lado do poço, utilizar uma pipeta de transferência limpa para lavá-los para dentro do poço, com a solução de tratamento. </li><li> Colocar a placa na incubadora a 28,5 ° C. Embriões serão analisados ​​quanto à fluorescência no 72 hpf. </li></ol> 3. Automated imagem de embriões em placas de 96 poços <ol><li> Anestesiar os embriões por adição de 10 uL de 4 mg / ml tricaina a cada poço. NOTA: Anestesie embriões antes da imagem. Na 24-96 hpf, peixe-zebra exibem movimento espontâneo e uma resposta de sobressalto para a fonte de luz mudando durante a captura da imagem. Anestesiar embriões reduz o movimento durante o exame. </li><li> Colocar a placa de 96 poços na plataforma motorizada e calibrar o palco. Usando 2011 software para microscopia automatica Zeiss Zen Azulon e controle, selecione a opção transportadora amostra e selecione multiwell 96. Selecione Calibrar. Siga as instruções passo a passo para calibrar o palco. NOTA: Não desmarque o botão azulejos após esta etapa. Se o botão de telhas é desmarcada, as configurações de calibragem podem ser perdidos ea placa de 96 poços terão de ser recalibrado. </li><li> Usando uma objetiva de 10x eo campo claro (BF) definir, identificar um embrião controle positivo e definir as configurações de exposição adequadamente para BF e canais de GFP, certificando-se que o sinal de fluorescência não está saturando a câmera. Concentre-se em um único embrião e programar o microscópio para adquirir 3 total de Z-seções, uma imagem 50 mm acima e outra 50 mm abaixo do plano focal atual. NOTA: Uma vez que os tecidos diferentes ocupam diferentes planos focais, o que irá garantir que para cada peixe-zebra imagens são capturadas com o coração eo fígado em foco. </li><li> Defina os parâmetros de software para adquirir uma imagem em mosaico usando GFP e BF channels. Sob a guia de aquisição, selecionar a configuração avançada. Selecionar as regiões de azulejos, então telhas. Escolha a opção de círculo bem. NOTA: ladrilhos é usada para criar uma imagem composta de cada poço. Um campo de visão-single captura apenas uma pequena parte de cada poço. A função de azulejos pode capturar automaticamente várias adjacente campos de visão de cada poço, criando uma imagem composta de todo o bem. Por conseguinte, é possível captar automaticamente 96 imagens compostas por placa, em que cada imagem composta contém várias dezenas de imagens individuais a partir de um único poço. </li><li> Escolha operadora e preencher fator de 90%. A seleção de um fator de preenchimento de 90% irá capturar várias imagens dos poços selecionados de tal forma que 90% da área de cada poço será visível na imagem composta. NOTA: Ao selecionar o fator de preenchimento, um diagrama será exibido representando a área a ser trabalhada. Selecione uma porcentagem que vai incluir a área do poçoque é apropriado para a experiência. </li><li> Em Opções, selecione a quantidade de sobreposição desejado. NOTA: Quando costurando telhas para uma única imagem representativa, uma sobreposição de 5-10% permite uma costura suave entre imagens. No entanto, se a imagem de costura é necessário, utilizando uma sobreposição 0% irá reduzir o tempo de imagiologia. Utilização de factor de enchimento de 90% e 5% de sobreposição, uma imagem composta de um único poço consiste de 59 imagens individuais. </li><li> Comece imagem. O microscópio irá adquirir automaticamente as imagens. </li><li> Inspeccionar manualmente imagens compostas de cada poço para fluorescência específica de tecido (Figura 1). </li><li> NOTA: É melhor começar com o controle positivo para confirmar que a exposição a substâncias químicas trabalhou antes de observar poços de tratamento experimental. </li></ol> 4. Manual de captura de imagem de Embriões em placa de 96 poços NOTA: Para confirmar os resultados, use uma objetiva de 20x distância de trabalho longa para acquire imagens mais detalhadas manualmente (Figura 2). <ol><li> Usando uma objetiva de 20x eo campo claro (BF) definir, identificar um embrião controle positivo e definir as configurações de exposição para os canais de BF e GFP adequadamente, certificando-se que o sinal de fluorescência não está saturando a câmera. </li><li> Identificar embriões individuais e capturar imagens manualmente. NOTA: Uma vez que as configurações de exposição foram selecionados para o embrião controle positivo, não alteram as configurações. Esta permite uma comparação da intensidade de fluorescência para cada imagem é capturada em condições uniformes. </li></ol>

<ol>
	<li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens.">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).</li><li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish.">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li><li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish.">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li><li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+A+tool+for+chemical+screens.">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li><li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos.">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li><li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+reporter+quantification+in+vivo:+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish.">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+estrogen+response+element.">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li><li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation.">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book:+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , (2000).</li></ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Este protocolo descreve um método simples para automaticamente a imagem de fluorescência de tecido específico em embriões de peixe-zebra. O protocolo foi desenvolvido utilizando uma Zeiss Axio Observer. Z1 com software Zen azul 2011, no entanto, a técnica pode ser adaptada usando qualquer microscópio invertido com uma platina motorizada e software de controlo do microscópio que possa realizar a telha para criar imagens compostas. Equipar um microscópio invertido com um palco motorizado pode fornecer uma alternat...

Paulistinha transgênico foram desenvolvidos que permitem a visualização direta de atividade em vias de sinalização, como fatores de crescimento de fibroblastos 1, o ácido retinóico 2 e 3 estrógenos, em embriões vivos. Estas ferramentas permitem o rastreio de produtos químicos que perturbam as vias de sinalização (ensaiado como uma mudança na intensidade de fluorescência) ou por produtos químicos que modulam a sinalização de um modo específico do tecido (alteração na fluorescência de localização) 4. Captura de imagem automatizado aumenta a taxa de transferência de telas químicas dramaticamente 5,6. Telas que fluorescência automaticamente ensaio no peixe-zebra ao vivo muitas vezes dependem de caros, equipamentos especializados. O chamado de triagem de alto teor fornece o benefício de alta resolução, imagens quantitativas, mas ao custo de usar leitores de placas especializadas equipadas para microscopia confocal 7,8. O objectivo deste método é a fluorescência específica de tecido automaticamente ensaio em embriões de peixe-zebraem uma placa de 96 poços, utilizando um microscópio de epifluorescência padrão. Fluorescência de tecidos específicos podem ser distinguidos utilizando esta técnica e pode ser uma abordagem razoável para laboratórios que não têm acesso a leitores de placas especializadas ou equipamentos de alta teor de triagem. Neste protocolo, usamos de imagens automatizado para detectar receptor de estrogênio tecido específico (ER) agonistas em peixe-zebra ao vivo em três dias após a fertilização (dpf). A linhagem transgênica Tg (5xERE: GFP) c262/c262 contém 5 seqüências em tandem de resposta de estrogênio elementos de DNA (ERE) a montante da proteína verde fluorescente (GFP) 3. Na ausência de ligando, ERs são normalmente inactivos. Ligação do ligante desencadeia uma mudança conformacional, permitindo que os receptores para ligar DNA ERE e regulam a transcrição 9. 5xERE: peixe GFP pode ser utilizado para pesquisar bibliotecas químicas para moduladores de ER e pode ser utilizado para rastrear as amostras de água do meio ambiente para os contaminantes estrogênicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:885px;" width="886">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:451px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; wide bore</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; fine tip</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well, round, flat bottom plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">21-377-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 x 35mm paltes</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 60mm plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dumont #5 fine forceps</td>
			<td style="width:100px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tricane methanesulfonate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040-25G</td>
			<td>see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629-10G</td>
			<td>Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 &#956;M in E3B&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20x long working distance objective</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiocam HRm digital camera</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ZenBlue 2011 microscope control software</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;MB-1; 25 grams</td>
			<td>make 2% solution in RO water for use in E3B (below)</td>
		</tr>
		<tr height="273">
			<td height="273" style="height:273px;">E3B</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">60X E3 SOLUTION: 
			NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 17.2 grams 
			KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.76 grams 
			CaCl2-2H2O&#160;&#160;&#160;&#160; - 2.9 grams 
			MgSO4-7H2O&#160; - 4.9 grams or MgSO4 &#8211; 2.39 grams 
			Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 
			 
			1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 
			60X E3&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 150mls 
			2% methylene blue&#160;&#160;&#160;&#160; 100&#956;l&#160; 
			Bring to 9 liters with Milli-Q water 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos

Embriões de peixe-zebra são uma poderosa ferramenta para a triagem em larga escala de pequenas moléculas. Zebrafish transgênicos que expressam proteínas repórter fluorescentes são freqüentemente usados ​​para identificar os produtos químicos que modulam a expressão do gene. Telas químicas que ensaio de fluorescência no peixe-zebra ao vivo muitas vezes dependem de caros, equipamentos especializados para rastreio de alto conteúdo. Nós descrevemos um procedimento usando um microscópio de epifluorescência padrão com um palco motorizado a imagem automaticamente embriões de peixes-zebra e detectar a fluorescência de tecido específico. Usando zebrafish transgênicos que relatam a atividade do receptor de estrogênio via expressão de GFP, foi desenvolvido um processo semi-automatizado para triagem de ligantes do receptor de estrogênio que ativam o repórter de uma forma específica de tecido. Neste vídeo, descrevemos os procedimentos para arraying embriões de peixe-zebra em 24-48 horas pós fertilização (hpf) em uma placa de 96 poços e adicionando pequenas moléculas que se ligam receptores de estrogênio. Em 72-96 hpf, imagens de cada poço a partir detoda a placa são coletados automaticamente e inspecionados manualmente para fluorescência de tecido específico. Este protocolo demonstra a capacidade para detectar os estrogénios que activam os receptores de válvulas cardíacas, mas não no fígado.

A Figura 1 mostra imagens compósitas a partir de poços individuais de uma placa de 96 poços. Cada imagem composta é composta de 59 imagens individuais com 5% de imagem de sobreposição. Note-se que o peixe-zebra vivos são orientadas aleatoriamente dentro de cada poço, ainda que são capazes de distinguir da fluorescência no coração a partir do fígado. Imagens de campo claro, são úteis como referências para avaliar a orientação peixe-zebra e visualizar anormalidades morfológicas ...

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Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Descrito aqui é um protocolo para a imagem semi-automatizada de fluorescência de tecido específico em embriões de peixe-zebra.

Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

semi-automated-imaging-tissue-specific-fluorescence-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K visualizações.  University of Alabama at Birmingham.  Descrito aqui é um protocolo para a imagem semi-automatizada de fluorescência de tecido específico em embriões de peixe-zebra. 