Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области архитектуры хроматина, такие как, как 3D структура хроматина может влиять на экспрессию генов и развитие. Основным преимуществом этой техники является то, что она обеспечивает высокое разрешение зрения хроматин архитектуры и точно поставил летать эмбрионов. Хотя этот метод может дать представление об организации и разработке хроматина, можно также использовать существующие линии из трансгенных библиотек мух, чтобы проверить их влияние в организации хроматина.
Для начала протокола отрегулируйте общий объем ранее собранных эмбрионов до двух миллилитров с помощью PBST. Добавьте в воду шесть миллилитров гептана и 100 микролитров 37%формальдегида. После добавления формальдегида, энергично встряхнуть трубку вверх и вниз в течение одной минуты.
Aqueous и органические фазы будет сочетаться с формой шампуня, как консистенция. Агитировать смесь на роторный миксер в течение 10 минут. Центрифуга трубки в 500 раз г в течение одной минуты при комнатной температуре для сбора эмбрионов в нижней части трубки.
Аспирировать всю шампунь, как жидкость и отказаться от него, заботясь, чтобы не аспирировать любые эмбрионы. Через 15 минут после добавления формальдегида, повторное распределение эмбрионов в пяти миллилитров PBST с 125 миллимолярный глицин. Встряхните эмбрионы вверх и вниз энергично в течение одной минуты.
После центрифугирования, аспирировать супернатант. Используя трубу из 1000 микролитров, перенесите партию из 100 эмбрионов в небольшой стеклянный сосуд, пригодный для сортировки, предпочтительно на темном фоне и поместите его на лед. Сортировать эмбрионы по ядерной плотности и статусу клеточного цикла с помощью иглы или кончика шприца.
Удалите все митотические эмбрионы, узнаваемые по их рассеянному, неядерному распределению EGFP PCNA и эмбрионов, которые частично показывают неядерный сигнал GFP. Чтобы помочь сортировке, выстроить эталонные эмбрионы на ядерных циклах 12, 13 и 14 в каждой партии, чтобы соответствовать эмбрионов с одним из эталонных эмбрионов. Пипетты желаемых эмбрионов с помощью 1000 микролитров пипетки.
Перенесите их в свежую трубку и поместите их на лед. Продолжайте до тех пор, пока достаточное количество эмбрионов не будет отсортировано для запланированного эксперимента. Спиновые трубки кратко при 100 раз г при комнатной температуре.
Удалите супернатант и убедитесь, что эмбрионы как можно более сухими для замораживания. Вспышка заморозить эмбрионы путем погружения труб в жидкий азот и хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Поместите трубки с замороженными эмбрионами на лед.
Повторное течение эмбрионов в 500 микролитров ледяного лиза буфера. Подождите одну минуту, чтобы позволить эмбриону осесть на дне трубки. Далее, молоть эмбрионы с металлической микро пестик предварительно охлаждается на льду, который предназначен для плотно подходят 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки.
Чтобы избежать агитации эмбрионов, вставьте пестик медленно, пока он не коснется нижней части трубки. Нажмите вниз, а затем молоть, вращая пестик дважды в обоих направлениях. Поднимите пестик очень немного.
Нажмите на дно трубки снова и повторить процедуру шлифования 10 раз или до тех пор, пока эмбрионы полностью lysed. Раствор должен быть однородным и не должны оставаться остаточными крупными кусками эмбрионов. Инкубировать гомогенизованную подвеску на льду в течение 15 минут.
Спин при 1000 раз г четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут. Отбросьте супернатант и промыть гранулы путем повторного перерасхода в 500 микролитер ледяной лиза буфера и трубопроводов вверх и вниз. После очередного вращения отбросьте супернатант.
Перепрофилировать промытые гранулы в 100 микролитров 0,5%Натрия Додекил Сульфат или SDS. Затем пронизывают ядра, инкубируя образец в течение 10 минут при 65 градусах Цельсия в нагревательном блоке. Добавьте 50 микролитров 10%Triton X100 и 120 микролитров воды.
Флик трубки, чтобы смешать содержимое и инкубировать трубку при температуре 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут в тепловом блоке. Добавьте 25 микролитров ферментного буфера ограничения 10X и 20 единиц по пять единиц на микролитер MBO1. Флик трубки, чтобы смешать содержимое и инкубировать трубку в тепловом блоке, чтобы переварить ДНК.
Добавьте еще 20 единиц MBO1. Продолжить инкубацию в течение 90 минут. После второй 90-минутной инкубации инкубировать образец при 62 градусах по Цельсию в течение 20 минут, чтобы неактивный MBO1.
Далее добавьте 18 микролитров 0,4 миллимолярный биотин 14-dATP, 2,25 микролитров неизмененной 3,3 миллимолярной смеси dCTP-dGTP-dTTP и восемь микролитров по пять единиц на микролитр ДНК-полимеразу I Klenow fragment. Флик трубки смешать содержимое и инкубировать образец при 37 градусов по Цельсию в течение 90 минут. Далее добавьте 657 микролитров воды, 120 микролитров буфера 10X T4 dna ligase, 100 микролитров 10%Triton X100, шесть микролитров по 20 миллиграммов на миллилитр альбумин сыворотки крупного рогатого скота и, наконец, пять микролитров по пять единиц на микролитр ДНК T4.
Затем аккуратно поверните трубку при температуре 20 об/мин при комнатной температуре в течение двух часов. Добавьте еще пять микролитров по пять единиц на микролитер T4 ДНК-лигазы. Продолжайте вращаться еще два часа, затем вращайся вниз по ядрам в 2500 раз г в течение пяти минут.
После центрифугации отбросьте супернатант. Resuspend гранулы в 500 микролитров извлечения буфера и добавить 20 микролитров 20 миллиграммов на миллилитр proteinase K.Flick трубки и инкубировать трубку, чтобы переварить белок. Добавьте 130 микролитров пяти хлорида натрия моляра и инкубировать на ночь, чтобы де-кросслинк.
На следующий день пипетка образца в новую двухми миллилитровую трубку с низкими характеристиками связывания ДНК. Добавьте 0,1X объем трех ацетат молярного натрия и два микролитра по 15 миллиграммов на миллилитр GlycoBlue. Добавьте 1,6 тома чистого абсолютного этанола и инвертировать содержимое, а затем инкубировать образец при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение 15 минут.
После инкубации центрифуга содержимого. Найдите гранулы ДНК, которые могут быть замечены только GlycoBlue. Удалите супернатант тщательно, перемещая кончик пипетки в трубку вдоль противоположной стенки из гранулы ДНК.
Вымойте гранулы с 800 микролитров 70% этанола. Смешайте образец путем инвертирования и центрифуги его в 20000 раз г при комнатной температуре в течение пяти минут. Удалите оставшиеся капли во время этого шага и следующие моет, выталкивая их из трубок с кончиком P10, а затем открыть крышку для сухого воздуха на срок до пяти минут.
Как только жидкость не остается, добавьте 50 микролитров хлорида 10 миллимолярной трис. Неоднократно пипетки раствор над областью, где гранулы был расположен, чтобы solubilize ДНК. Добавьте один микролитр по 20 миллиграммов на миллилитр RNase A.Mix, щелкивая трубку.
Инкубировать образец при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут, чтобы переварить РНК. Наконец, хранить образец в морозильной камере или холодильнике до подготовки библиотеки. Изображения сигнала EGFP PCNA каждой отсортированной партии эмбриона показывают точные состояния стадии и клеточного цикла каждого эмбриона для экспериментов ниже по течению.
Биоанализерные следы показывают, что распределение размера фрагментов ДНК после выбора размера составляет от 300 до 700 базовых пар с максимумом около 450 базовых пар. Карты взаимодействия Hi-C показывают, что на ядерном цикле 12 обнаруживается несколько топологически связанных доменов или TAD, которые резко меняются на ядерных циклах 13 и 14, когда TAD все более заметные и неспецифические контакты дальнего радиуса действия истощаются. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы мыть бисер тщательно и не продлевать инкубации раз излишне особенно при высоких температурах, поскольку это может привести к низкому качеству Hi-C библиотек.
Этот метод, сочетающий точную постановку и карту подтверждения хроматина высокого разрешения, проложил путь для исследователей в области эпигенетики, чтобы исследовать роль трехмерной организации хроматина в условиях развития in vivo.
