Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы, связанные с экспрессией генов, показывающие нам, как именно хроматин структура влияет на экспрессию генов и как хроматин организация регулирует транскрипционные динамики. Мы разработали эту технологию, потому что мы хотели быть в состоянии управляемо изменять хромосомную архитектуру, чтобы создать цикл дальнего хроматина. Хотя в то же время имеют возможность обратить вспять контекст хроматина для восстановления эндогенной хромосомной структуры.
Этот метод был разработан для простоты использования и широкой применимости. Мы воспользовались нетоксичным димеризатором, а также ортогональным видом dcas9, чтобы позволить использовать систему более широко. Мы разработали этот метод, потому что мы хотели быть в состоянии ответить на давний курица-и-яйцо вопрос о том, экспрессия генов порождает хромосомной архитектуры или же хромосомная структура приводит к изменениям в экспрессии генов.
В текстовом протоколе описана конструкция последовательностей РНК CRISPR-руководства и поддержание клеточных культур. Плазмид карты и грунтовки используются перечислены там дюйма Начните плазмидный препарат, смешивая пять микрограммов лентивирусной плазмиды CRISPR с тремя микролитров BsmB1 тремя микролитров щелочной фосфатазы шестью микролитров буфера пищеварения 10x и 0,6 микролитров свежеприготовленных 100 миллимолейр DTT.
Доведите общий объем до 60 микролитров двойной дистиллированной воды и инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут, чтобы переварить и де-фосфорилат плазмиды. Затем гель очищает переваренную плазмиду в петле плазмидной и двойной дистиллированной воды. Далее подготовьтесь к аннелинг-реакциям для пар РНК-руководства.
Объедините один микролитер каждой направляющий РНК на 100 микромолейных с одним микролитером 10x T4 перевязочных буферов 6,5 микролитров двойной дистиллированной воды и 0,5 микролитров T4 PNK для общего объема реакции 10 микролитров. Чтобы аннеал руководство РНК пар их целевых последовательностей инкубировать смеси при температуре 37 градусов по Цельсию в 30 минут, а затем инкубации при 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут, а затем постепенно снизить температуру до 25 градусов по Цельсию, уменьшая его на пять градусов по Цельсию в минуту. Далее разбавить annealed руководство РНК на один-двести в двойной дистиллированной воды.
Теперь подготовь две реакции перевязки. Смешайте один микролитер переваренной плазмиды с 0,5 микролитров разбавленного периванального направляющий RNAse 2,5 микролитров 2x буфера перевязки один микролитер двойной дистиллированной воды и 0,5 микролитров лигазы. Инкубировать реакции при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы ligate направляющие BsmB1 переваривается плазмида.
Затем преобразуйте недавно перевязанные плазмиды в стабильные три бактерии и усиливайте бактерии, используя любой метод плазмидной подготовки. На шести-хорошо пластины, на колодец, семена 750000 2n3 Tcells в DMEM с 10%FBS и 1%pen strep. Используйте один колодец для каждой конструкции и инкубировать клетки в течение 24 часов.
На следующий день, изменить средний на свежий антибиотик бесплатно-DMEM с 10%FBS. Сразу после смены среды для каждой колодец потроха клетки готовят трубку из лентивирусной производственной смеси. За каждую реакцию разбавляют 11 микролитров липидо-базового трансфектного реагента 150 микролитров среды Opti-MEM для каждой реакции.
Затем в отдельных трубках готовят ДНК. Объедините два микрограмма плазмиды переносчика CLOud9 с двумя микрограммами других компонентов лентивирусной упаковки. Разбавить эту смесь в 150 микролитров opti-MEM среды.
Затем объединить равные объемы разбавленной лентивирусной плазмидной смеси в разбавленной липидной трансфекции реагента и инкубировать смеси в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем к каждому колодец клеток добавляют одну трубку подготовленных смесей и продолжают инкубацию. 48 часов спустя, передача вирусных средств производства из пластины скважин в конические и спина их вниз на 300 г в течение пяти минут.
Затем перенесите супернатант в свежие трубки, чтобы выбросить гранулированное мусор. Теперь, немедленно используйте вирусные средства производства для трансдуци целевых клеток или заморозить его при 80 градусах по Цельсию для использования в будущем. Начните с добавления 250 микролитров каждой вирусной конструкции, которая в данном случае состоит из дополнительных плазмидов CLOud9 в 50 миллилитровую коническую трубку, содержащую 80 000 клеток.
Затем добавьте достаточно Полибрена так, чтобы он был между одним и восемью микрограммами на миллилитр в растворе. Затем отрегулируйте общий объем в каждой трубке до одного миллилитра с помощью средств массовой информации, свободных от антибиотиков. Теперь, чтобы увеличить контакт между частицами вируса и клетками спина клетки на 800 г в течение 30 минут при комнатной температуре.
Затем повторно приостанавливать клетки на супернатанте путем пипетки. Затем загрузите подвеску клеток на пластины культуры и инкубировать их в течение 24 часов. На следующий день соберите клетки.
Центрифуга их при температуре 300 г в течение пяти минут при комнатной температуре и повторно приостановить их в нормальной среде. На следующий день добавьте пуромицин и гигромицин в среду, чтобы выбрать для двойной трансуцированных клеток. Соответствующая концентрация антибиотиков должна быть определена заранее для каждого типа клеток.
Затем инкубировать ячейки в средствах отбора, по крайней мере три дня, прежде чем приступить к вниз по течению приложений и продолжать поддерживать ячейки и средства отбора. Для затемнения CLOud9 выбранных и трансдуцированных клеток добавить один миллимоляр ABA в культуру блюдо. Для элементов управления добавьте DMSO, а затем поддерживайте ячейки с ABA или DMSO в течение всего эксперимента.
Чтобы обратить вспять димеризацию, мыть клетки с достаточным PBS, чтобы покрыть поверхность пластины в два раза. После этого, культурные ячейки в ABA-свободных средств массовой информации, чтобы поддерживать их в неразмертом состоянии. Надлежащее использование системы CLOud9 вызывает обратимый контакт дополнительных конструкций CSA и CSP CLOud9 путем добавления или удаления АБА в средства массовой информации культуры клеток.
Конструкции CSA и CSP локализованы в соответствующих геномных регионах с использованием стандартного руководства CRISPR RNAse. Хроматин иммунопреципиентации следуют количественные ПЦР был использован для обеспечения точной локализации в ориентации каждого компонента CLOud9. Дополнительно coimmunoprecipation с и без ABA проверено CSA и CSP dimerization в присутствии ligand также, как reversibility в отсутствии ligand.
После димеризации ABA, больший контакт между бета-глобином и LCR был измерен захватом подтверждения хромосомы. Однако этого не наблюдалось в контролях, содержащих либо только КСА, либо только конструкцию CSP. Создание взаимодействия LCR бета-глобина не полностью исключило эндогенный контакт LCR globin.
Он только добавил к исходному контакту. Увеличение контактов бета-глобина LCR наблюдалось в течение 72 часов димеризации независимо от точного региона в пределах целевого LCR или бета-глобина промоутер области. Наконец, обратимость системы была подтверждена с захватом подтверждения хромосомы после удаления ABA.
Это привело к полному возобновлению эндогенного подтверждения. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы изменить средства массовой информации и добавить свежие затемненные CLOud9 трансдуцированных клеток каждый день. Не забывайте, что работа с лентивирусом может быть чрезвычайно опасной, и все меры предосторожности, используемые в BSL 2, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
