Маленький Rho GTPase является белком суперсемьи с разнообразной клеточной функцией. Например, эти белки участвуют в регуляции судьбы клеток, клеточной реакции на стресс, клеточной подвижности и клеточного цикла. Активность небольшого белка Rho GTPase регулируется пост-трансляционной модификацией.
Эти изменения связаны с жестким регулированием их деятельности. Например, белковая прениляция и связь GTP являются наиболее важной послематчевой модификацией этих белков. Моя лаборатория недавно модифицировала и разработала простой метод для исследования пост-трансляционной модификации этих суперсемейных белков.
Для этого мы использовали 251 линию клеток глиобластомы, нацеливая их на симвастатин, и измеряли пост-трансляционную модификацию этих белков. Метод включает в себя субклеточную фракциацию и ГТП связанный белок с этой белковой суперсемьей. Для этого мы использовали локализацию RhoA, и GTP связан с RhoA для измерения пост-трансляционной модификации этого белка.
Удалите клетки из 37-градусного инкубатора. Посмотрите на клетки под микроскопом, чтобы подтвердить слияние. Клетки должны быть на 70 до 80 процентов стечения.
Вымойте клетки один раз с холодной PBS. Добавьте пять миллилитров ЭДТА и поместите клетки обратно в 37-градусный инкубатор в течение пяти минут. После пяти минут инкубации, собирать EDTA с клетками в 15 миль трубки.
Поместите трубку в ледяную коробку и приступайте к центрифуге. Установите центрифугу до 1500 г при четырех градусах и вращаем клетки в течение пяти минут. После спина, удалить супернат, и добавить один миллилитр холодного PBS.
Тритурировать клетки хорошо. Перенесите клеточную смесь в новую помеченную трубку с маркировкой 1,5 миллилитров. После перевода перейти к центрифуге.
Установите центрифугу до 1500г при четырех градусах, и спина клеток в течение пяти минут. Проверьте размер гранул. Поместите образцы на лед.
Откажитесь от суперната полностью, не нарушая гранулы. Добавьте buffer One. Хорошо перемешать, трубя вверх и вниз.
Приступайте к звуковой работе. Установите звуковой в течение пяти циклов, пять секунд каждый, и повторить три раза. Sonication должны продолжаться на льду, но не показано в видео, для иллюстративных целей.
Перейти к ультрацентрифуге. Используйте ультрацентрифуг, чтобы разделить однородные клетки на цитоплазмические и мембранные фракции. Установите центрифугу до 100 000г в течение 35 минут, при четырех градусах.
Проверьте размер гранул. Отделить супернат. Соберите супернат полностью, будьте осторожны, чтобы не беспокоить гранулы.
Супернат является цитозоловой фракцией. Поместите супернат в недавно помеченную трубку. Добавьте буфер два к грануле.
Это мембранная фракция. Хорошо перемешать, трубя вверх и вниз. Приступайте к определению белка и подготовке западного образца помарки.
Загрузите образцы на SDS-PAGE с помощью 15%-геля. Подтвердите передачу протеина путем визуализировать молекулярный маркер веса, или используя пятно Ponceau. Добавьте первичные антитела для иммуноблоттинга.
Мы используем Rac1/2/3, Cdc42 и RhoA. Вывеми тарелки культуры из инкубатора. Посмотрите на клетки под микроскопом, чтобы подтвердить слияние.
Клетки должны быть от 70 до 80% стечения. Поместите культурную тарелку на лед. Аспирировать средства массовой информации и мыть клетки с ледяной PBS pH'd до 7,2.
Аспирировать PBS. Наклоните пластины на льду в течение дополнительной минуты, чтобы удалить все остатки PBS. Остаточный PBS отрицательно влияет на этот анализ.
Подлизать клетки в соответствующем объеме ледяного лиза буфера, содержащего протеазы и ингибиторы фосфатазы. Клетка урожая лисируют с скребком клетки. Наклонить культурную пластину для этой техники.
Перенесите лисат в помеченную, ледяную криока трубку и держите на льду. Тщательно смешайте с помощью вихря. Держите 10 микролитров лизата для анализа белка.
Привязать заморозить оставшиеся клетки лизат в жидком азоте. Перенесите замороженные криотрубы в морозильную камеру минус 80. Храните эти образцы.
Обратите внимание, что образцы не должны храниться дольше 14 дней. Подготовка ячейки лисирует от других пластин культуры, повторяя шаги один к восьми, один за другим. Работа быстро, и никогда не оставляйте образцы на льду дольше, чем 10 минут.
Никогда не обрабатывая все пластины культуры одновременно. Измерьте концентрацию белка. Рассчитайте объем буфера лиза для нормализации концентрации белка между образцами.
Примечание: один миллиграмм на миллилитр, как правило, лучший, однако, от 0,3 до двух миллиграммов на миллилитр можно обнаружить. Подготовь пустой элемент управления, добавив 60 микролитров буфера лиза и 60 микролитров связывающего буфера в микротрубки. Подготовь положительный контроль, добавив 12 микролитров белка Rho control, 48 микролитров буфера лиза и 60 микролитров связывающего буфера.
Возьмите Rho сродство пластины из сумки и место на льду. Растворите порошок в колодцах 100 микролитров ледяной дистиллированной воды. Держите тарелку на льду.
Оттепель оснастки замороженных клеток лизирует в водяной бане установлен до 25 градусов по Цельсию. Добавьте рассчитанный объем буфера холодного льда к каждому образцу для нормализации концентрации белка. Перенесите 60 микролитров нормализованных проб ледяного холода на микротрубки и добавьте 60 микролитров связывающего буфера.
Тщательно перемешать и держать на льду. Полностью удалите воду с микроплюна энергичным стряхивания, а затем пять-семь жестких кранов на лабораторном коврике. Добавьте 50 микролитров нормализованных образцов, пустой контроль и положительный контроль скважин в дублировании.
Поместите пластину на орбитальный шейкер в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию. Примечание: скорость шейкера должна быть установлена до 300 об/мин. Очистите образцы от пластины, стряхивая, и мыть дважды с 200 микролитров буфера мытья комнатной температуры.
Энергично удалить стиральный буфер из колодцев после каждой стирки, стряхивая, а затем нажав, и держать пластину на скамейке при комнатной температуре. Добавьте в каждую колодец 200 микролитров антигенного буфера комнатной температуры и инкубировать при комнатной температуре в течение двух минут. Флик из раствора из колодцев, и мыть три раза с 200 микролитров буфера мытья комнатной температуры.
Добавьте 50 микролитров свежеприготовленных от одного до 250 первичных антител анти-RhoA к каждому хорошо. Поместите пластину на орбитальный шейкер в течение 45 минут при 300 об/мин, установленных до 25 градусов по Цельсию. Вынюхив раствор из колодцев, и мыть три раза с 200 микролитров стирального буфера при комнатной температуре.
Добавьте 50 микролитров свежеприготовленных от одного до 250 анти-RhoA вторичных антител к каждому хорошо. Поместите пластину поверх орбитального шейкера в течение 45 минут при 300 об/мин, установленных до 25 градусов по Цельсию. Подготовь реагент обнаружения HRP, смешивая равные объемы реагента А и реагента B.Flick из раствора из каждой хорошо, и мыть три раза с 200 микролитров буфера мытья комнатной температуры.
Добавьте 50 микролитров свежеприготовленного реагента обнаружения HRP в каждую колодец. Прочитайте сигнал люминесценции в течение трех-пяти минут, чтобы получить максимальный сигнал. Проанализируйте результаты с помощью соответствующего пакета программного обеспечения.
Наши результаты показывают, что симвастатин снизил локализацию RhoA в мембранной фракции. Увеличилось накопление цитозолической фракции. Интересно, что симвастатин увеличил GTP связан с RhoA.Why?
Мы ожидаем снижения симвастатина этой активности. Очень важно, чтобы они измеряли как субклеточную локализацию этого белка, так и измеряли привязку GTP к этому белку, чтобы иметь окончательную оценку активности малых Rho GTPases.
