O pequeno Rho GTPase é uma proteína de uma superfamília com diversas funções celulares. Por exemplo, essas proteínas estão envolvidas na regulação do destino celular, resposta celular a um estresse, motilidade celular e ciclo celular. A atividade de uma pequena proteína Rho GTPase é regulada por modificação pós-translacional.
Essas modificações estão envolvidas na regulação rigorosa de sua atividade. Como exemplo, a prenilização da proteína e o vínculo GTP são a modificação pós-tradução mais importante dessas proteínas. Meu laboratório recentemente modificou e desenvolveu método simples para investigar a modificação pós-translacional dessas proteínas superfamílias.
Para isso, utilizamos 251 linhas celulares de glioblastoma, e as direcionamos com simvastatina, e medimos modificação pós-translacional dessas proteínas. O método envolve fracionamento subcelular e proteína ligada ao GTP a essa superfamília proteica. Para isso, utilizamos a localização de RhoA, e GTP vinculado à RhoA para medir a modificação pós-translacional desta proteína.
Remova as células da incubadora de 37 graus. Olhe para as células sob o microscópio para confirmar a confluência. As células devem estar entre 70% e 80% confluentes.
Lave as células uma vez com PBS frio. Adicione cinco mililitros de EDTA, e coloque as células de volta na incubadora de 37 graus por cinco minutos. Após cinco minutos de incubação, colete EDTA com células em um tubo de 15 mil.
Coloque o tubo em uma caixa de gelo, e vá para a centrífuga. Configure a centrífuga para 1500g a quatro graus, e gire as células por cinco minutos. Após o giro, remova o supernato e adicione um mililitro de PBS frio.
Triturar bem as células. Transfira a mistura celular para um novo tubo de 1,5 mililitro rotulado. Após a transferência, prossiga para a centrífuga.
Coloque a centrífuga em 1500g a quatro graus, e gire as células por cinco minutos. Verifique o tamanho da pelota. Coloque as amostras no gelo.
Descarte o superata completamente, sem perturbar a pelota. Adicione buffer one. Misture bem por pipetting para cima e para baixo.
Prossiga para a sônica. Defina o sonicator para cinco ciclos, cinco segundos cada, e repita três vezes. A sônicação deve continuar no gelo, mas não é mostrada no vídeo, para fins ilustrativos.
Vá para o ultracentrifuge. Use uma ultracentrifugação para separar as células homogeneiza em frações citoplasmáticas e membranas. Coloque a centrífuga em 100.000g por 35 minutos, a quatro graus.
Verifique o tamanho da pelota. Separe o supernato. Colete o supernato completamente, tomando cuidado para não perturbar a pelota.
O supernato é a fração citosófica. Coloque o supernato em um tubo recém-rotulado. Adicione buffer dois à pelota.
Esta é a fração da membrana. Misture bem por pipetting para cima e para baixo. Proceda à determinação da proteína e à preparação da amostra de manchas ocidentais.
Carregue as amostras em um SDS-PAGE usando um gel de 15%. Confirme a transferência de proteínas visualizando o marcador de peso molecular, ou usando uma mancha de Ponceau. Adicione anticorpos primários para análise de imunoblotting.
Usamos Rac1/2/3, Cdc42 e RhoA. Tire as placas de cultura da incubadora. Olhe para as células sob o microscópio para confirmar a confluência.
As células devem ser 70 a 80% confluentes. Coloque a placa de cultura no gelo. Aspire a mídia e lave as células com pbs frio gelado pH'd a 7.2.
Aspire a PBS. Incline as placas no gelo por mais um minuto para remover todos os restos de PBS. O PBS residual afeta negativamente este ensaio.
Lise as células em um volume apropriado de tampão de lise gelada contendo inibidores de protease e fosfatase. Colher liseto celular com o raspador de células. Incline a placa de cultura para esta técnica.
Transfira o lysate para um tubo criogênico rotulado e gelado, e mantenha no gelo. Misture bem usando um vórtice. Mantenha 10 microliters do lysate para um ensaio proteico.
Es clique para congelar o restante do lise celular em nitrogênio líquido. Transfira os criobotos congelados instantâneos para um congelador menos 80. Guarde essas amostras.
Note que as amostras não devem ser armazenadas por mais de 14 dias. Prepare as células das outras placas de cultura repetindo passos de um a oito, um por um. Trabalhe rápido e nunca deixe as amostras no gelo por mais de 10 minutos.
Nunca manuseie todas as placas de cultura simultaneamente. Meça a concentração de proteínas. Calcule o volume do tampão de lise para normalizar a concentração de proteína entre as amostras.
Nota: um miligrama por mililitro é geralmente o melhor, no entanto, 0,3 a dois miligramas por mililitro pode ser detectável. Prepare um controle em branco adicionando 60 microliters de tampão de lise e 60 microliters de buffer de ligação a um microtubo. Prepare um controle positivo adicionando 12 microliters de proteína de controle Rho, 48 microliters de tampão de lise e 60 microliters de tampão de ligação.
Tire a placa de afinidade rho de seu saco e coloque no gelo. Dissolva o pó nos poços com 100 microliters de água gelada destilada. Mantenha a placa no gelo.
Descongele as células congeladas em um banho de água a 25 graus Celsius. Adicione o volume calculado de tampão de lise gelada a cada amostra para normalizar a concentração proteica. Transfira 60 microliters de amostras de gelo normalizadas para microtubos, e adicione 60 microliters de buffer de ligação.
Misture bem e mantenha no gelo. Remova completamente a água da microplaca por um movimento vigoroso, seguido de cinco a sete torneiras duras em um tapete de laboratório. Adicione 50 microliters das amostras normalizadas, um controle em branco e um controle positivo aos poços em duplicata.
Coloque a placa em um agitador orbital por 30 minutos a quatro graus Celsius. Nota:a velocidade do agitador deve ser definida a 300 rpm. Limpe as amostras da placa piscando e lave duas vezes com 200 microliters de tampão de lavagem de temperatura ambiente.
Remova vigorosamente o tampão de lavagem dos poços após cada lavagem, seguindo-se por toques, e mantenha a placa no banco em temperatura ambiente. Adicione 200 microliters de tampão de temperatura ambiente em cada poço e incubar à temperatura ambiente por dois minutos. Retire a solução dos poços e lave três vezes com 200 microliters de tampão de lavagem de temperatura ambiente.
Adicione 50 microliters de um recém-preparado para 250 anticorpos primários anti-RhoA a cada poço. Coloque a placa em um agitador orbital por 45 minutos a 300 rpm, fixada em 25 graus Celsius. Retire a solução dos poços e lave três vezes com 200 microliters de tampão de lavagem à temperatura ambiente.
Adicione 50 microliters de um recém-preparado para 250 anticorpos secundários anti-RhoA a cada poço. Coloque a placa em cima de um agitador orbital por 45 minutos, a 300 rpm, fixada em 25 graus Celsius. Prepare o reagente de detecção hrp misturando volumes iguais de Reagente A e Reagente B.Flick a solução de cada poço, e lave três vezes com 200 microliters de tampão de lavagem de temperatura ambiente.
Adicione 50 microliters de reagente de detecção HRP recém-preparado a cada poço. Leia o sinal de luminescência dentro de três a cinco minutos para obter um sinal máximo. Analise os resultados usando um pacote de software apropriado.
Nossos resultados mostram que a simvastatina diminuiu a localização de RhoA na fração da membrana. O que aumentou foi o acúmulo na fração citosófica. Curiosamente, a simvastatina aumentou o GTP ligado ao RhoA.Por quê?
Esperamos que a simvastatina diminua essa atividade. É muito importante que eles meçam tanto a localização subcelular desta proteína, quanto medem a ligação GTP a esta proteína para ter uma avaliação final da atividade dos pequenos Rho GTPases.
