Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области обнаружения инсектицидов и борьбы с переносчиками. Например, насколько токсична непроверенная химия для популяции личинок комаров или взрослых? Есть ли у химии потенциал для развития как ларвицида, так и взрослого?
И, что может быть наиболее эффективным маршрутом доставки? Основными преимуществами этого метода являются то, что он может быть использован для оценки токсичности непроверенных химических веществ Токсичность химии против нескольких видов комаров-переносчиков, и она может быть увеличена до evalute сотни соединений в высокой пропускной способности. Демонстрация процедуры будет Jasleen Каур, научный техник из моей лаборатории.
Для начала, этикетка колодцы 24-хорошо пластины культуры тканей. Используйте аналитический баланс для взвешивания тестового соединения. Затем, запустение соединения в стерильной двойной дистиллированной воды в 1,5 мл трубки, в результате чего 80mM фондовый раствор.
Далее, последовательно разбавить фондовый раствор с помощью двойной дистиллированной воды для подготовки рабочих решений фонда желаемых концентраций. Обратите внимание, что необходимо позаботиться о личинках добавляются в скважины, во время удаления избыточной воды, и когда тест химии добавляется, чтобы избежать физического повреждения личинок. Травмы могут привести к увеличению смертности и, таким образом, привести к ложноположительную оценку или признать анализ недействительным.
Используйте широкую пластиковую трубу для переноса пяти третьих личинок instar в каждую скважину пластины. Затем используйте один mL пипетки, чтобы аккуратно удалить воду, и заменить его на желаемый объем двойной дистиллированной воды. Позаботьтесь, чтобы не коснуться личинок при удалении воды работать быстро, чтобы личинки не высовылись, и осторожно добавить химию теста, трубя против противоположной стороны пластиковой хорошо.
Добавьте соответствующий объем тестового решения к каждой хорошо, и аккуратно поверните пластину, чтобы обеспечить равномерное смешивание. Поместите пластину в камеру роста, поддерживая 12-часовой световой/темный цикл при 25 градусах цельсия при относительной влажности от 75 до 85 процентов. Чтобы проверить движение личинок, аккуратно коснитесь пластины.
Если движения не наблюдается, осторожно коснитесь личинки стерильной зубочисткой. Оценка личинки, как мертвые, если не ответ не заметил, и использовать счет листа для записи общего числа мертвых личинок в каждой хорошо, в то время точки, описанные в текстовом протоколе. Культура трех-пятидневных взрослых самок комаров в 20-литровой пластиковой клетке.
Этикетка девять унций бумажных стаканчиков с названием и концентрацией испытательного соединения. Затем приготовьте 10 мг/мл раствора испытательного соединения в ацетоне в стеклянном флаконе 20 мл. Затем последовательно разбавляют бульонный раствор, чтобы получить желаемые рабочие концентрации.
Очистите один mL стеклянный шприц с ацетоном. Затем заполните его тестовым раствором при соответствующей концентрации. Защитите шприц в микро-аппликаторе с поправкой на объем 0,25uL.
Далее, используйте аспиратор, чтобы удалить 10, три-пять дней взрослых самок комаров из клетки. Обезботь их в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию. Затем перенесите комаров в чашку Петри.
Поместите блюдо на лед на 10 минут. Во избежание повреждения взрослых комаров, которые могут привести к смертности, убедитесь, что они не обезболены в холодильнике в течение более пяти минут, или обездвижены на льду более 10 лет, и свести к минимуму обращение с комарами. Если у вас есть доступ к холодной пластине, и микроманипулятор с подвижной стадии, что может еще больше свести к минимуму обработку комаров.
Используйте тонкие пинцеты, чтобы удалить каждого комара из блюда. С помощью шприца микроаппликатор нанесите 0,25 мл испытательного раствора на спинную грудную клетку, под рассекающий микроскоп Next, перенесите комаров на маркированную бумажную чашку на льду. Печать чашку с 10 на 10 см сетки площади и резинкой Затем, передать его в камеру роста, и записывать количество мертвых комаров, как описано ранее.
Соберите примерно 150 четырех-пятидневных взрослых самок комаров с аспиратором и перенесите их в отдельную клетку. Удалите источник сахара за 1-24 часа до начала кормления. Подготовь 80-метровый раствор испытательного соединения в воде.
Затем, последовательно разбавлять его водой, чтобы получить рабочие решения фонда желаемых концентраций. Чтобы получить желаемые концентрации тестирования, добавить 40uL каждого разбавления до 960uL дефибрированной крови кролика в 1,5 мл трубки, и перемешать с помощью пипетки. Поместите фильтр-член на кормовой блок и запечатав его резиновым кольцом.
Далее используйте пипетку для передачи одного мл крови с помощью тестового раствора через порт доставки, расположенный на обратной стороне кормового блока. Прикрепите блок питания к отопительному блоку. Затем аккуратно мазите поверхность мембраны свежеприготовленным 10-процентным раствором молочной кислоты.
Поместите кормуху в клетку. Накройте клетку темной тканью и дайте комарам покормить в течение часа. После того, как комары питаются, поместите клетку в холодильник при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут, чтобы обезботь комаров.
Затем подсчитайте и замитмийте общее количество комаров в клетке. Изучая брюшной полости, подсчитайте и зачитайте общее количество полностью и частично питающихся самок комаров. Минимум 50 комаров, питаемых кровью, должны быть получены за дозу.
Удалите комаров, которые не кормили. Затем перенесите клетку в камеру роста и используйте лист для записи количества мертвых комаров в соответствующие моменты времени. На третий день после крови кормления, место eggcup в клетке в течение 72 часов.
Используйте рассечение микроскопа, чтобы подсчитать общее количество яиц, произведенных за лечение. Анализ личинок контакт был выполнен для оценки влияния амитриптилина, антагониста рецепторов допамина, на личиночной смертности с течением времени. Данные показали, что значение LC 50 уменьшается с течением времени эксперимента.
Влияние амитриптилина на смертность взрослых самок комаров было сравнено с бифентрином и двумя отрицательными показателями контроля. По сравнению с ацетоном, обработанным и необработанным негативным контролем, как амитриптилин, так и бифентрин индуцируют значительную смертность в каждой экспериментальной точке времени. Был проведен количественный анализ кормления для оценки влияния трех различных доз амитриптилина на плодовитость и процентную смертность взрослых самок комаров.
Данные не выявили статистически значимой разницы в плодовитости амитриптилина кормили комаров в самой высокой дозе по сравнению с только крови кормили контроля. После освоения, любой из анализов мы описали здесь, может быть завершена примерно за два часа одним человеком, если должным образом выполнены. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы мягко обращаться с организмом, и не должно быть последовательности во время актуальных приложений и во время скоринга личинки или взрослых анализ.
Следуя этой процедуре, другие методы, такие как био-анализы для оценки токсичности с помощью поглощения, через комаров tarsi, CDC бутылки анализа, и анализ трубки ВОЗ могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся эффективности непровереной химии, или сформулированный продукт, и потенциал для развития в качестве контактного инсектицида или космического спрея.
