Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nei campi della scoperta di insetticidi e del controllo vettoriale. Ad esempio, quanto è tossica una chimica non formata per una popolazione di larve di zanzara o adulti? La chimica ha un potenziale di sviluppo come larvicida o adulticida?
E quale potrebbe essere il percorso di consegna più efficace? I principali vantaggi di questa tecnica sono che può essere utilizzata per valutare la tossicità delle sostanze chimiche non formate La tossicità di una chimica contro più specie di zanzare vettoriali e può essere scalata fino a valutare centinaia di composti ad alta capacità di produttività. A dimostrare la procedura sarà Jasleen Kaur, un tecnico scientifico del mio laboratorio.
Per iniziare, etichettare i pozzi di una piastra di coltura tissutale a 24 po '. Utilizzare una bilancia analitica per pesare il composto di prova. Quindi, disolvere il composto in acqua sterile a doppia distillazione in un tubo da 1,5 ml, con conseguente soluzione stock da 80 mM.
Successivamente, diluire in serie la soluzione stock utilizzando acqua distillata doppia per preparare soluzioni di stock di lavoro delle concentrazioni desiderate. Si noti che bisogna fare attenzione le larve vengono aggiunte ai pozzi, durante la rimozione dell'acqua in eccesso e quando viene aggiunta la chimica del test per evitare danni fisici alle larve. La lesione può aumentare la mortalità, e quindi produrre risultati falsi positivi o invalidare il saggio.
Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica a foro largo per trasferire cinque terzi larve instar in ogni pozzo della piastra. Quindi, utilizzare una pipetta da un mL per rimuovere delicatamente l'acqua e sostituirla con il volume desiderato di acqua distillata doppia. Fare attenzione a non toccare rapidamente le larve quando si rimuove l'acqua per assicurarsi che le larve non desiccano e aggiungere delicatamente la chimica di prova pipettando contro il lato opposto del pozzo di plastica.
Aggiungere un volume appropriato di soluzione di prova a ciascun pozzo e ruotare delicatamente la piastra per garantire una miscelazione uniforme. Posizionare la piastra in una camera di crescita mantenendo un ciclo chiaro/scuro di 12 ore a 25 gradi celsius con umidità relativa dal 75 all'85%. Per controllare il movimento larvale, toccare delicatamente il piatto.
Se non si osserva alcun movimento, toccare delicatamente la larva con uno stuzzicadenti sterile. Segna la larva come morta se non viene notata alcuna risposta e usa un foglio di punteggio per registrare il numero totale di larve morte in ogni pozzo, nei punti di tempo descritti nel protocollo di testo. Cultura zanzare femmine adulte di tre o cinque giorni in una gabbia di plastica da 20 litri.
Etichettare tazze di carta da nove oncia con il nome e la concentrazione del composto di prova. Successivamente, preparare una soluzione stock da 10 mg/mL del composto di prova in acetone in una fiala di vetro da 20 mL. Quindi, diluire in serie la soluzione stock per ottenere le concentrazioni di lavoro desiderate.
Pulire la siringa di vetro da un mL con acetone. Quindi riempirlo con la soluzione di prova alla concentrazione appropriata. Fissare la siringa in un micro-applicatore regolato per fornire un volume di 0,25uL.
Successivamente, usa un aspiratore per rimuovere le zanzare adulte di 10, tre o cinque giorni dalla gabbia. Anestetizzarli per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi trasferire le zanzare in una piastra di Petri.
Mettere il piatto sul ghiaccio per 10 minuti. Al fine di evitare di danneggiare la zanzara adulta, che potrebbe contribuire alla mortalità, assicurarsi che non vengano anestetizzati in frigo per più di cinque minuti o immobilizzati sul ghiaccio per più di 10 e ridurre al minimo la gestione delle zanzare. Se si ha accesso a una piastra fredda e a un micromanipolatore con uno stadio mobile, ciò potrebbe ridurre ulteriormente la manipolazione delle zanzare.
Usa una pinzetta fine per rimuovere ogni zanzara dal piatto. Con il micro-applicatore della siringa applicare 0,25uL di soluzione di prova al torace dorsale, sotto un microscopio di sezionazione Next, trasferire le zanzare in una tazza di carta etichettata sul ghiaccio. Sigillare la tazza con un quadrato di rete da 10 per 10 cm e un elastico Quindi, trasferirla nella camera di crescita e registrare il numero di zanzare morte come descritto in precedenza.
Raccogli circa 150 zanzare femmine adulte di età da quattro a cinque giorni con un aspiratore e trasferiscile in una gabbia separata. Rimuovere la fonte di zucchero da una a 24 ore prima del test di alimentazione. Preparare una soluzione stock da 80 mM del composto di prova in acqua.
Quindi, diluirlo serialmente con acqua, per ottenere soluzioni di stock di lavoro delle concentrazioni desiderate. Per ottenere le concentrazioni di prova desiderate, aggiungere 40uL di ogni diluizione a 960uL di sangue di coniglio defibrinato in un tubo da 1,5 ml e mescolare mediante pipettazione. Posizionare un filtro membro su un'unità di alimentazione e sigillare con un anello di gomma.
Successivamente, utilizzare una pipetta per trasferire un mL del sangue con soluzione di test attraverso la porta di erogazione, situata sul retro dell'unità di alimentazione. Collegare l'unità di alimentazione a un'unità di riscaldamento. Quindi tamponare delicatamente la superficie della membrana con una soluzione di acido lattico al 10%.
Posizionare l'unità di alimentazione nella gabbia. Coprire la gabbia con un panno scuro e consentire alle zanzare di nutrirsi per un'ora. Dopo che le zanzare si nutrono, metti la gabbia in frigorifero a quattro gradi Celsius per cinque minuti per anestetizzare le zanzare.
Quindi, conta e registra il numero totale di zanzare nella gabbia. Esaminando l'addome, contare e registrare il numero totale di zanzare femminili alimentate completamente e parzialmente. Dovrebbero essere ottenute almeno 50 zanzare nutrite con sangue per dose.
Rimuovere le zanzare che non si sono nutrite. Successivamente, trasferire la gabbia in una camera di crescita e utilizzare un foglio di punteggio per registrare il numero di zanzare morte nei punti di tempo appropriati. Il terzo giorno di alimentazione post-sangue, metti un eggcup nella gabbia per 72 ore.
Utilizzare un microscopio sezionato per contare il numero totale di uova prodotte per trattamento. È stato eseguito un saggio di contatto larvale per valutare l'effetto dell'amitriptilina, un antagonista del recettore della dopamina, sulla mortalità larvale nel tempo. I dati hanno rivelato che il valore di LC 50 diminuisce nel corso del tempo dell'esperimento.
L'effetto dell'amitriptilina sulla mortalità delle zanzare femminili adulte è stato confrontato con la bifentrina e due controlli negativi. Rispetto ai controlli negativi trattati con acetone e non trattati, sia l'amitriptilina che la bifentrina hanno indotto una mortalità significativa in ogni momento sperimentale. È stato eseguito un test quantitativo di alimentazione per valutare l'effetto di tre diverse dosi di amitriptilina sulla fecondità e sulla mortalità percentuale delle zanzare femminili adulte.
I dati non hanno rivelato alcuna differenza statisticamente significativa nella fecondità delle zanzare alimentate con amitriptilina alla dose più alta rispetto ai soli controlli alimentati a sangue. Una volta padroneggiato, uno qualsiasi dei saggi che abbiamo descritto qui, può essere completato in circa due ore da un singolo individuo, se eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di maneggiare delicatamente l'organismo e dovrebbe esserci coerenza durante le applicazioni topiche e durante il punteggio di test larvali o adulti.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come i bio-test per valutare la tossicità attraverso l'assorbimento, attraverso i tarsi delle zanzare, il saggio della bottiglia CDC e il saggio del tubo dell'OMS al fine di rispondere a ulteriori domande riguardanti l'efficacia della chimica non formulata, o un prodotto formulato, e il potenziale di sviluppo come insetticida a contatto o spray spaziale.
