Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave nos campos de descoberta de inseticidas e controle de vetores. Como, quão tóxica é uma química não formulada para uma população de larvas de mosquitos ou adultos? A química tem potencial para o desenvolvimento como larvicida ou adultídio?
E qual pode ser a rota de entrega mais eficaz? As principais vantagens desta técnica são que ela pode ser usada para avaliar a toxicidade de químicas não formuladas A toxicidade de uma química contra múltiplas espécies de mosquitos vetoriais, podendo ser dimensionada para evitar centenas de compostos em alta capacidade de rendimento. Demonstrando o procedimento estará Jasleen Kaur, um técnico científico do meu laboratório.
Para começar, rotule os poços de uma placa de cultura de tecido de 24 poços. Use um equilíbrio analítico para pesar o composto de teste. Em seguida, dessole o composto em água dupla destilada estéril em um tubo de 1,5mL, resultando em uma solução de estoque de 80mM.
Em seguida, diluir em série a solução de estoque usando água dupla destilada para preparar soluções de estoque de trabalho das concentrações desejadas. Note que devem ser tomados cuidados as larvas são adicionadas aos poços, durante a remoção do excesso de água, e quando a química do teste é adicionada para evitar danos físicos às larvas. A lesão pode aumentar a mortalidade e, assim, produzir resultados falsos positivos ou invalidar o ensaio.
Use uma pipeta de transferência de plástico larga para transferir cinco terços das larvas instar para cada poço da placa. Em seguida, use uma pipeta de um mL para remover suavemente a água e substitua-a pelo volume desejado de água dupla destilada. Tome cuidado para não tocar nas larvas ao remover a água trabalhar rapidamente para garantir que as larvas não desscasquem, e adicione suavemente a química do teste, pipetando contra o lado oposto do poço plástico.
Adicione um volume apropriado de solução de teste a cada poço e gire suavemente a placa para garantir a mistura uniforme. Coloque a placa em uma câmara de crescimento mantendo o ciclo claro/escuro de 12 horas a 25 graus celsius com 75 a 85% de umidade relativa. Para verificar o movimento larval, bata suavemente na placa.
Se não for observado nenhum movimento, toque suavemente na larva com um palito estéril. Marque a larva como morta se nenhuma resposta for notada, e use uma folha de pontuação para registrar o número total de larvas mortas em cada poço, nos pontos de tempo descritos no protocolo de texto. Cultura de três a cinco dias de mosquitos adultos em uma gaiola de plástico de 20 litros.
Rotule nove copos de papel de nove onças com o nome e concentração do composto de teste. Em seguida, prepare uma solução de estoque de 10mg/mL do composto de teste em acetona em um frasco de vidro de 20mL. Em seguida, diluir em série a solução de estoque para obter as concentrações de trabalho desejadas.
Limpe a seringa de vidro de um mL com acetona. Em seguida, preencha-o com a solução de teste na concentração apropriada. Fixar a seringa em um microaplicador ajustado para entregar um volume de 0,25uL.
Em seguida, use um aspirador para remover mosquitos adultos de 10, 3 a 5 dias de idade da gaiola. Anestesia-os por cinco minutos a quatro graus celsius. Em seguida, transfira os mosquitos para uma placa de petri.
Coloque o prato no gelo por 10 minutos. Para evitar danificar o mosquito adulto, o que poderia contribuir para a mortalidade, garantir que eles não sejam anestesiados na geladeira por mais de cinco minutos, ou imobilizados no gelo por mais de 10, e minimizar o manuseio dos mosquitos. Se você tiver acesso a uma placa fria, e um micromanipulador com um estágio móvel, isso pode minimizar ainda mais o manuseio dos mosquitos.
Use pinças finas para remover cada mosquito do prato. Com o micro-aplicador da seringa aplicar 0,25uL de solução de teste para o tórax dorsal, sob um microscópio de dissecação Em seguida, transfira os mosquitos para um copo de papel rotulado no gelo. Sele o copo com um quadrado de malha de 10 por 10cm e um elástico, transfira-o para a câmara de crescimento, e registe o número de mosquitos mortos como descrito anteriormente.
Colete aproximadamente 150 mosquitos adultos de quatro a cinco dias com um aspirador e transfira-os para uma gaiola separada. Remova a fonte de açúcar de um a 24 horas antes do ensaio de alimentação. Prepare uma solução de estoque de 80mM do composto de teste na água.
Em seguida, dilui-o em série com água, para obter soluções de estoque de trabalho das concentrações desejadas. Para obter as concentrações de teste desejadas, adicione 40uL de cada diluição a 960uL de sangue de coelho desfibriado em um tubo de 1,5mL, e misture por pipetação. Coloque um filtro de membro em uma unidade de alimentação e sele-o com um anel de borracha.
Em seguida, use uma pipeta para transferir um mL do sangue com solução de teste através da porta de entrega, localizada no lado inverso da unidade de alimentação. Conecte a unidade de alimentação a uma unidade de aquecimento. Em seguida, cotonete a superfície da membrana suavemente com solução de ácido láctico recém-preparada.
Coloque a unidade de alimentação na gaiola. Cubra a gaiola com um pano escuro, e deixe os mosquitos se alimentarem por uma hora. Após a alimentação dos mosquitos, coloque a gaiola em uma geladeira a quatro graus celsius por cinco minutos para anestesiar os mosquitos.
Então, conte e regise o número total de mosquitos na gaiola. Examinando o abdômen, conte e regise o número total de mosquitos fêmeas totalmente e parcialmente alimentados. Um mínimo de 50 mosquitos alimentados com sangue deve ser obtido por dose.
Remova os mosquitos que não se alimentaram. Em seguida, transfira a gaiola para uma câmara de crescimento, e use uma folha de pontuação para registrar o número de mosquitos mortos nos pontos de tempo apropriados. No terceiro dia de alimentação pós-sangue, coloque uma xícara de ovo na gaiola por 72 horas.
Use um microscópio de dissecação para contar o número total de ovos produzidos por tratamento. Foi realizado um ensaio de contato larval para avaliar o efeito da amitriptilina, antagonista do receptor de dopamina, sobre a mortalidade larval ao longo do tempo. Os dados revelaram que o valor da LC 50 diminui ao longo do tempo do experimento.
O efeito da amitriptilina na mortalidade de mosquitos fêmeas adultas foi comparado com a bifenthrina, e dois controles negativos. Em comparação com os controles negativos tratados com acetona e não tratados, tanto amitriptilina quanto a bifenthrina induziram mortalidade significativa em cada ponto de tempo experimental. Foi realizado um ensaio quantitativo de alimentação para avaliar o efeito de três doses diferentes de amitriptilina na fecundidade e porcentagem de mortalidade de mosquitos fêmeas adultas.
Os dados não revelaram diferença estatisticamente significativa na fecundidade dos mosquitos alimentados com amitriptilina em dose mais alta em comparação com apenas controles alimentados com sangue. Uma vez dominado, qualquer um dos ensaios que descrevemos aqui, pode ser concluído em aproximadamente duas horas por um único indivíduo, se devidamente realizado. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear suavemente o organismo, e deve haver consistência durante aplicações tópicas e durante a pontuação de larvas ou ensaio adulto.
Após esse procedimento, outros métodos como bioensídeos para avaliar a toxicidade via absorção, através do mosquito tarsi, do ensaio de garrafas CDC e do ensaio do tubo da OMS podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais sobre a eficácia da química não formulada, ou um produto formulado, e potencial de desenvolvimento como inseticida de contato ou spray espacial.
