Bu yöntem, böcek bulma ve vektör kontrol alanlarında ki anahtar soruların yanıtlatına yardımcı olabilir. Sivrisinek larvaları veya yetişkinler için formüle edilmemiş bir kimya ne kadar zehirlidir? Kimya bir larvicide veya yetişkin öldürücü olarak gelişme potansiyeli var mı?
Ve, en etkili teslimat yolu ne olabilir? Bu tekniğin başlıca avantajları, formüle edilmemiş kimyaların toksisitesini değerlendirmek için kullanılabilmeve bir kimyanın toksisitesini birden fazla vektör sivrisinek türüne karşı değerlendirmek ve yüksek iş yapma kapasitesinde yüzlerce bileşiğin evalute'ye kadar ölçeklendirilebilir. Prosedürü gösteren Jasleen Kaur, benim laboratuvar bir bilim teknisyeni olacaktır.
Başlamak için, 24 kuyulu doku kültürü plakasının kuyularını etiketlayın. Test bileşiğini tartmak için analitik bir denge kullanın. Daha sonra, 1.5mL tüp steril çift distile su bileşik çözmek, 80mM stok çözeltisi ile sonuçlanan.
Daha sonra, istenilen konsantrasyonlarda çalışan stok çözeltileri hazırlamak için çift distile su kullanarak stok çözeltisini seri olarak seyreltin. Larvaların kuyulara eklenmesine özen ilmesi gerektiğini unutmayın, fazla suyun uzaklaştırılması sırasında ve larvaların fiziksel zarar görmesini önlemek için test kimyası eklendiğinde. Yaralanma mortaliteyi artırabilir ve böylece yanlış pozitif sonuçlar üretebilir veya tahtı geçersiz kılabilir.
Plakanın her kuyuya beş üçüncü instar larvası aktarmak için geniş delikli plastik transfer pipetkullanın. Daha sonra, suyu nazikçe çıkarmak için tek bir mL pipet kullanın ve istenilen çift distile su hacmiyle değiştirin. Larvaların kurumaması için su işini hızlı bir şekilde çıkarırken larvalara dokunmamaya dikkat edin ve plastik kuyunun karşı tarafına boru larvası atarak test kimyasını nazikçe ekleyin.
Her kuyuya uygun miktarda test çözümü ekleyin ve düzgün karıştırmayı sağlamak için plakayı hafifçe döndürün. Plakayı, yüzde 75-85 bağıl nem oranıyla 25 santigrat derecede 12 saatlik açık/koyu döngüyü koruyan bir büyüme odasına yerleştirin. Larva hareketini kontrol etmek için, yavaşça plakadokunun.
Hareket gözlenmezse, larvaya steril kürdanla hafifçe dokunun. Yanıt fark edilmezse larvayı ölü olarak puanlayın ve metin protokolünde açıklanan zaman noktalarında her kuyudaki toplam ölü larva sayısını kaydetmek için bir puan tablosu kullanın. Kültür 20 litrelik plastik kafeste 3-5 günlük yetişkin dişi sivrisinekler.
Etiket dokuz ons kağıt bardak adı ve test bileşik konsantrasyonu ile. Daha sonra, 20mL cam şişe de aseton test bileşik 10mg / mL stok çözüm hazırlamak. Daha sonra, istenilen çalışma konsantrasyonları elde etmek için seri stok çözeltisi seyreltmek.
Bir mL cam şırıngayı asetonile temizleyin. Daha sonra uygun konsantrasyonda test solüsyonu ile doldurun. Şırıngayı 0,25uL hacim sağlayacak şekilde ayarlanmış bir mikro aplikatöre sabitle.
Sonra, kafesten 10, üç ila beş günlük yetişkin dişi sivrisinek kaldırmak için bir aspiratör kullanın. Onları dört santigrat derecede beş dakika anestezi edin. Sonra sivrisinekleri petri kabına aktarın.
10 dakika buz üzerine çanak yerleştirin. Ölümlülüğe katkıda bulunabilecek yetişkin sivrisineğin zarar görmemesi için buzdolabında beş dakikadan fazla anestezi alınmamasını veya 10 dakikadan fazla buzüzerinde hareketsiz kalmamasını sağlayın ve sivrisineklerin kullanımını en aza indirin. Eğer soğuk bir plaka erişimi niz varsa, ve hareketli bir sahne ile bir mikromanipülatör, daha fazla sivrisinek işleme en aza indirebilirsiniz.
Çanak her sivrisinek kaldırmak için ince cımbız kullanın. Şırınga mikro-aplikatör ile dorsal toraks için test çözeltisi 0.25uL uygulayın, bir diseksiyon mikroskop altında Sonraki, buz üzerinde etiketli bir kağıt fincan sivrisinek aktarın. Mühür fincan 10 tarafından 10cm örgü kare ve bir lastik bant Sonra, büyüme odasına aktarın ve daha önce açıklandığı gibi ölü sivrisinek sayısını kaydedin.
Yaklaşık 150 dört ila beş günlük yetişkin dişi sivrisinek bir aspiratör ile toplamak ve ayrı bir kafese aktarın. Besleme tsay'ından 1 ila 24 saat önce şeker kaynağını çıkarın. Sudaki test bileşiğinin 80 mM'lik stok çözeltisini hazırlayın.
Daha sonra, seri su ile seyreltmek, istenilen konsantrasyonlarda çalışma stok çözümleri elde etmek için. İstenilen test konsantrasyonları elde etmek için, 1.5mL tüp içinde defibrinated tavşan kanı 960uL her seyreltme 40uL ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Bir besleme ünitesine üye filtre yerleştirin ve kauçuk bir halka ile kapatın.
Daha sonra, besleme ünitesinin ters tarafında bulunan dağıtım portu üzerinden test solüsyonu ile kan bir mL aktarmak için bir pipet kullanın. Besleme ünitesini Bir ısıtma ünitesine takın. Daha sonra, membran yüzeyini taze hazırlanmış yüzde 10 laktik asit çözeltisi ile hafifçe temizler.
Besleme ünitesini kafese yerleştirin. Kafesi koyu bir bezle örtün ve sivrisineklerin bir saat boyunca beslenmesini bekleyin. Sivrisinekler besledikten sonra, sivrisinekleri canlandırmak için kafesi dört derece buzdolabında beş dakika bekletin.
Daha sonra kafesteki toplam sivrisinek sayısını sayın ve kaydedin. Karın inceleyerek, saymak ve tam ve kısmen beslenen dişi sivrisinek toplam sayısını kaydedin. Doz başına en az 50 kanla beslenen sivrisinek elde edilmelidir.
Beslenen olmayan sivrisinekleri çıkarın. Daha sonra kafesi bir büyüme odasına aktarın ve uygun zaman noktalarındaki ölü sivrisinek sayısını kaydetmek için bir puan tablosu kullanın. Kan sonrası beslenmenin üçüncü gününde, kafese 72 saat boyunca bir yumurta fincanı koyun.
Tedavi başına üretilen toplam yumurta sayısını saymak için bir kesme mikroskobu kullanın. Dopamin reseptör antagonisti olan amitriptinin zaman içinde larva mortalitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için larva kontrayı araştırması yapıldı. Veriler, LC 50 değerinin deney boyunca zaman içinde azaldığını ortaya koymuştur.
Amitriptiline'nin erişkin dişi sivrisineklerin mortalitesi üzerindeki etkisi bifenthrin ve iki negatif kontrol ile karşılaştırıldı. Aseton ile tedavi edilen ve tedavi edilmeyen negatif kontrollere kıyasla, her deneysel zaman noktasında hem amitriptirin hem de bifenthrin önemli mortaliteye neden oldu. Erişkin dişi sivrisineklerin fecundity ve yüzde mortalitesi üzerine üç farklı dozda amitriptinin etkisini değerlendirmek için kantitatif beslenme tetkikçisi yapıldı.
Veriler, sadece kanla beslenen kontrollere kıyasla en yüksek dozda amitriptirin lebeslenen sivrisineklerin dışkısında istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamadır. Bir kez hakim, burada açıklanan tahliller herhangi biri, düzgün yapılırsa, tek bir birey tarafından yaklaşık iki saat içinde tamamlanabilir. Bu yordamı çalışırken, organizmayı nazikçe idare etmeyi unutmamak önemlidir ve topikal uygulamalar sırasında ve larva veya yetişkin testi puanlama sırasında tutarlılık olmalıdır.
Bu prosedürü takiben, biyo-tahliller gibi diğer yöntemler emme yoluyla toksisite değerlendirmek için, sivrisinek tarsi yoluyla, CDC şişe tahlil, ve WHO tüp tahlil formüle edilmemiş kimya etkinliği ile ilgili ek soruları cevaplamak için yapılabilir, ya da formüle edilmiş bir ürün, ve bir temas böcek ilacı veya uzay spreyi olarak geliştirme potansiyeli.
