Общая цель этого протокола заключается в том, чтобы описать изготовление органных сколов микрофлюидных устройств для повторного повторения функциональности уровня органов in vitro. Этот протокол описывает способ изготовления устройств с сколами органов, резюмируемых функцией уровня органов в пробирке. Func, устройства, такие как эти, на самом деле изготовлены с использованием 3D печатных форм из мягкой резины кремния.
Эта резина позволяет нам на самом деле наполнить эти устройства с механическими сигналами, что позволяет нам растянуть ткани, как вы получите, скажем, легких или кишечника. Мы также добавляем изобилие, которое имитирует кровоток и поток других жидкостей организма в системах органов. Теперь вместе взятые, эти устройства позволяют нам на самом деле воссоздать и попытаться понять сложную физиологию, что происходит в vivo.
Но сделай это в пробирке. По сути, мы экспериментируем с людьми, но не с людьми. Это очень эффективный способ преодоления разрыва между исследованиями на животных, которые всегда проводятся в доклиническом развитии терапевтических средств, а затем перед исследованиями на людях, которые называются клиническими испытаниями, где существует гораздо больший риск для человека, для безопасности человека.
Таким образом, эти устройства помогают преодолеть разрыв и фактически позволяют нам разрабатывать новые терапевтические методы и понимать основную биологию, которая на самом деле происходит в сложных системах, таких как человек. Подготовка верхнего канала. Протрите глянцевую сторону каждого полиуретана кусок этанола и чистой комнате салфетки.
Поместите глянцевую сторону полиуретана на открытую сторону формы на месте плесени. Поместите плесень и полиуретановые сборки в джиг, текстурированную сторону против конца джига. Продолжайте делать это до тех пор, пока все формы были помещены в джиг.
Затяните джиг, повернув ручку с помощью гаечного ключа, пока расстояние между джигами не будет 25 миллиметров в ширину. Сделать лодку из алюминиевой фольги окружающих плесень на месте джиг. Налейте PDMS в колодец каждой формы до полного.
После того, как весь джиг заполнен, поместите джиг в вакуумный децикатор. Через час снимите с децикатора. И поместите в 60 градусов по Цельсию духовку, по крайней мере четыре часа.
Разобрать джиг с помощью гаечного ключа. Удалите полиуретановые полоски из каждой формы. И отбросить.
Тщательно demold PDMS частей из их формы и заложить их особенностью вверх. Выстроить лезвие плитки скребок в конце вкладке выемки. И отрезать каждый конец, чтобы cingulate верхние компоненты.
Храните готовые детали в квадратных чашках Петри. Храните детали в шкафах положительного давления при комнатной температуре. Подготовка нижнего канала.
Налейте 10,5 граммов PDMS в форму. Воздушная пушка может быть использована очень мягко для перемещения PDMS над пространством. Поместите формы в вакуумный децикатор.
Через час перемести формы на уровень 60 градусов по Цельсию. Поместите плесень на стол в ламинарный капюшон потока. Ослабить PDMS от края формы.
Захватите один угол и аккуратно очистить PDMS от поверхности формы. При полном снятии, инвертировать и лежать на рабочей поверхности, так что функции канала лицом вверх. Вырезать по внешним краям с плиткой резак.
С плоским веслом миппы, лежал части особенностью сторону вверх на ленте, чтобы удалить любые обломки. Снимите часть с упаковочной ленты. Перетащите свободный конец части через слайд.
Свободный конец будет ламинировать со стеклом. Обложка с шотландской лентой. Храните детали в шкафах положительного давления при комнатной температуре.
Подготовка мембраны PDMS. Убедитесь, что свободны от PDMS на спине. Поместите каждую мембранную пластину в назначенные слоты.
Используйте один шприц mL для того чтобы поместить 09 mL PDMS на центр каждого массива столба мембраны. Пусть PDMS сидеть в течение как минимум пяти минут. Разрешить PDMS распространяться по всему столбу мембранной пластины.
Не переходите к следующему шагу до тех пор, пока по крайней мере 75% почтового массива не будет покрыто PDMS. Плазма обрабатывает поликарбонатную полосу с использованием условий, описанных в протоколе. Удалите поликарбонатный лист из плазменной машины и используйте ножницы, чтобы разрезать поликарбонатные листы на 45 миллиметров на 45 миллиметров квадратов.
Положите плазменную обработанную сторону поликарбонатных квадратов на PDMS, центрированную на мембранной пластине. Поместите ПРОМС-центр в центре поликарбонатной площади. Затем поместите предварительно вырезать текстурированный поликарбонат.
Вставьте лотки так, что лоток три находится в спину, лоток два находится в середине, и лоток один находится в передней. Tray одно имеет зазубрина для выравнивания. Откройте клапан вывихового давления и очень медленно откройте клапан входного давления.
Это делается для того, чтобы четыре килограмма силы постепенно применялись к каждой мембранной пластине, в отличие от мгновенной, которая может сломать. Переверните переключатель AMF, чтобы начать цикл лечения. Затем закройте клапан входного давления и откройте клапаны выходного давления, чтобы освободить давление от воздушных цилиндров.
Снимите подносы и довнесите их до капота ламинарного потока. Аккуратно снимите текстурированный поликарбонат. Аккуратно удалите промекать PDMS.
Проинспектировать мембрану PDMS для областей с через отверстия. Используйте маркер, чтобы проследить контур области отверстия. Также пометить любые отверстия или дефекты на мембранах.
Это пример немаркированной и отмеченной мембраны. Используя пинцет для обработки вафель, ослабьте из лотка. Удалите каждую мембрану из и поместите на чашку Петри.
Мембрана PDMS будет понижена от пластины и будет связана с поликарбонатной поддержкой. Храните детали в шкафах положительного давления при комнатной температуре. Верхняя сборка и подготовка.
Используя матовую готовую скотчую ленту, очистите мембраны PDMS, а также внутренности чашки Петри для удаления мусора. Тщательно ленты особенность стороны каждого высокого канала верхней для удаления мусора. Поместите верхушки в чашку Петри с мембраной PDMS.
Имейте в виду, что некоторые мембраны могут занять одну или две верхние части. Основные каналы каждой верхней части должны поместиться в пределах отмеченной области внутри мембраны. Загрузите посуду Петри в плазму.
Плазма лечения мембраны и верхней в соответствии с письменным протоколом. Как только цикл склеивания закончится, удалите посуду и положите активированные верхние части на мембрану. Поместите в 60 градусов по Цельсию духовку, по крайней мере два часа.
Используя скальпель, проследите по периметру кабебельного верха, чтобы отделить его от поликарбоната перевозчика. После того, как часть прослеживается, очистить верхнюю часть от поликарбоната. Мембрана PDMS, которая связана с верхней должны очистить от перевозчика, а также.
С помощью пинцета удалить мембрану из портов, которые получают доступ к нижнему каналу. Не оставляйте никаких частей мембраны, покрывающих порт доступа. Кроме того, удалите мусор или пыль с помощью пинцета.
Сборка чипов. Функция вверх, плазма лечения верхней сборки с дном. Под перевернутым микроскопом выровнять верхнюю сборку с нижней половиной.
Поместите в 60 градусов по Цельсию духовку, по крайней мере два часа. Результаты. Представленный здесь протокол описывает масштабируемое изготовление чипов органов PDMS. Эти устройства обеспечивают культуру двух различных типов обильных тканей на эластичной пористой мембране.
Каналы PDMS отлиты с помощью 3D печатных форм, что ускоряет прототипирование новых конструкций. Верхние каналы отлиты в формы под сжатием против совместимой полиуретаной прокладки для производства компонентов с формованными портами. В то время как компоненты нижнего канала отлиты в лотки и обрабатываются на поддержке слайда микроскопа.
Этот подход к изготовлению сочетает в себе многомасштабную структуру деталей в один шаг, что экономит время, улучшает воспроизводимость и прослеживаемость, а также уменьшает мусор, генерируемый штамповкой порта и несколькими шагами резки. Пористые мембраны имеют решающее значение для функции чипа органа, а подход к изготовлению, основанный на литье против узорчатых кремниевых пластин, приводит к тому, что мембраны имеют последовательную толщину и поверхностную отделку. Обработка с помощью поликарбонатных носителей позволяет более крупное производство и хранение партий.
Собранный органный чип состоит из двух каналов изобилия в оптически прозрачной упаковке. В перекрывающейся области пористая мембрана PDMS позволяет взаимодействию тканей и тканей метаболитов, белков, терапии, патогенных микроорганизмов и клеток, чтобы повторить функцию чипа органа, в то время как два параллельных канала с обеих сторон используются для обеспечения механического напряжения, используя циклическую вакуумную активацию. Пористость мембраны PDMS био-медицинской поддерживает поток метаболитов, факторов роста, и даже клетки между сосудами и органом parenchyma.
Очевидная проницаемость мембраны была определена с использованием ди-концентрации в каналах розетки с и без клеток кишечника Caco-2. Слои клеток кишечника чип обеспечивают значительно увеличенный барьер для проницаемости. Чип органа может быть приведен в действие с помощью параллельных вакуумных каналов для количественного и воспроизводимого применения циклической нагрузки штамма на мембрану, и, следовательно, культурные ткани.
Этот циклический штамм в сочетании с изобилием средств массовой информации поддерживает клеточную дифференциацию, чтобы лучше имитировать физиологию органов in vivo, такую как образование вилли в кишечнике чипа. Используя описанный здесь протокол, теперь вы должны иметь возможность изготовить растяжимый чип органа PDMS.
