L'obiettivo generale di questo protocollo è descrivere la fabbricazione di dispositivi microfluidici scheggiati di organi per ricapitolare la funzionalità a livello di organo in vitro. Questo protocollo descrive un modo per fabbricare dispositivi scheggiati di organi che ricapitolano la funzione del livello degli organi in vitro. Il func, i dispositivi, come questi, sono in realtà fabbricati utilizzando stampi stampati in 3D da una morbida gomma siliconica.
Questa gomma ci permette di infondere a questi dispositivi segnali meccanici che ci consentono di allungare il tessuto come si potrebbe entrare diciamo un polmone o un intestino. Aggiungiamo anche la profusione, che imita il flusso sanguigno e il flusso di altri fluidi corporei all'interno dei sistemi di organi. Presi insieme, questi dispositivi ci permettono di ricreare e cercare di capire la complessa fisiologia che accade in vivo.
Ma fallo in vitro. Quindi essenzialmente stiamo sperimentando sugli esseri umani, ma non sulle persone. E quindi è un modo molto efficace per colmare il divario tra gli studi sugli animali, che vengono sempre fatti nello sviluppo precli clinicalo delle terapie, e poi prima degli studi sull'uomo, che sono chiamati studi clinici, dove c'è un rischio molto maggiore per l'uomo, per la sicurezza umana.
Quindi questi dispositivi aiutano a colmare il divario e ci permettono di sviluppare nuove terapie e comprendere la biologia di base che accade effettivamente in sistemi complessi come l'uomo. Preparazione del canale superiore. Pulire il lato lucido di ogni pezzo di poliuretano con etanolo e salviette per camera pulita.
Posizionare il lato lucido del poliuretano sul lato aperto dello stampo nello stampo in posizione. Posizionare gli assiemi dello stampo e del poliuretano nel jig, lato strutturato contro l'estremità della giga. Continuare a farlo fino a quando tutti gli stampi non sono stati posizionati all'interno della giga.
Stringi la giga ruotando la maniglia usando una chiave inglese, fino a quando la spaziatura della giga è di 25 millimetri di larghezza. Crea una barca di lamina di alluminio che circonda lo stampo in posizione jig. Versare il PDMS nel pozzo di ogni stampo fino al completo.
Una volta riempita l'intera giga, posizionare la giga nell'essiccatore del vuoto. Dopo un'ora, rimuovere dall'essiccatore. E mettere in forno centigrado a 60 gradi per almeno quattro ore.
Smontare la giga usando una chiave inglese. Rimuovere le strisce di poliuretano da ogni stampo. E scartare.
Retrocedere accuratamente le parti PDMS dai loro stampi e posarle lato positivo verso l'alto. Allineare la lama del raschietto della piastrella alla tacca della linguetta finale. E tagliare ogni estremità per cinguire i componenti principali.
Conservare le parti finite in piatti petri quadrati. Conservare le parti in armadi a pressione positiva a temperatura ambiente. Preparazione del canale inferiore.
Versare 10,5 grammi di PDMS nello stampo. La pistola ad aria compressa può essere utilizzata molto delicatamente per spostare il PDMS nello spazio. Posizionare gli stampi nell'essiccatore sottovuoto.
Dopo un'ora, spostare gli stampi in un forno centigrado di livello 60 gradi. Posizionare lo stampo sul tavolo in una cappa di flusso laminare. Allentare il PDMS dal bordo dello stampo.
Afferrare un angolo e sbucciare delicatamente il PDMS dalla superficie dello stampo. Quando sono completamente rimossi, invertire e posare sulla superficie di lavoro in modo che le feature del canale siano a faccia in su. Tagliare lungo i bordi esterni con la fresa per piastrelle.
Con le forcelle piatte a pale, le parti di lay sono presenti lateralmente su nastro per rimuovere eventuali detriti. Rimuovere parte dal nastro di imballaggio. Trascinare l'estremità libera della parte attraverso la diapositiva.
L'estremità libera lamina con il vetro. Caratteristiche di copertina con nastro adesivo. Conservare le parti in armadi a pressione positiva a temperatura ambiente.
Preparazione della membrana PDMS. Verificare che i wafer siano liberi da PDMS sul retro. Posizionare ogni wafer di membrana negli slot designati.
Utilizzare la siringa da un mL per posizionare 09 ml di PDMS al centro di ogni array di post wafer di membrana. Lascia che il PDMS si sieda per un minimo di cinque minuti. Lasciare che il PDMS si diffonda in tutto il palo del wafer di membrana.
Non procedere al passaggio successivo fino a quando almeno il 75% dell'array di post non è coperto in PDMS. Il plasma tratta la striscia di policarbonato utilizzando le condizioni descritte nel protocollo. Rimuovere il foglio di policarbonato dalla macchina al plasma e utilizzare le forbici per tagliare i fogli di policarbonato in 45 millimetri per 45 millimetri quadrati.
Posare il lato trattato al plasma dei quadrati in policarbonato sul PDMS, centrato sul wafer a membrana. Posizionare il distanziale PDMS al centro del quadrato in policarbonato. Quindi posizionare il policarbonato strutturato pretaglio.
Inserire vassoi in modo che il vassoio tre sia nella parte posteriore, il vassoio due sia al centro e il vassoio uno sia nella parte anteriore. Il vassoio uno ha una tacca per l'allineamento. Aprire la valvola di pressione di uscita e aprire molto lentamente la valvola di pressione di ingresso.
Questo in modo che i quattro chilogrammi di forza vengono gradualmente applicati a ogni wafer di membrana, al contrario di quanto possa rompere istantaneamente i wafer. Capovolgere l'interruttore AMF per iniziare il ciclo di polimerizzazione. Quindi chiudere la valvola di pressione di ingresso e aprire le valvole di pressione di uscita per rilasciare la pressione dai cilindri dell'aria.
Rimuovere i vassoi e portarli nella cappa di flusso laminare. Staccare con cura il policarbonato testurizzato. Rimuovere con cura il distanziale PDMS.
Ispezionare la membrana PDMS per le aree con fori attraverso. Utilizzate un marcatore per tracciare il contorno dell'area del foro passante. Contrassegnare anche eventuali fori o difetti sulle membrane.
Questo è un esempio di membrana non marcata e marcata. Utilizzando una pinzetta per la gestione dei wafer, allentare i wafer dal vassoio. Rimuovere ogni membrana dal wafer e posizionarsi sulla piastra di Petri.
La membrana PDMS si demolderà dal wafer e sarà incollata al supporto in policarbonato. Conservare le parti in armadi a pressione positiva a temperatura ambiente. Montaggio e preparazione al top.
Utilizzando nastro scotch finito opaco, pulire le membrane PDMS e l'interno della piastra di Petri per rimuovere i detriti. Rastremere accuratamente il lato feature di ogni piano del canale alto per rimuovere i detriti. Posizionare i piani nella piastra di Petri con membrana PDMS.
Tenere presente che alcune membrane possono assumere una o due parti principali. I canali principali di ogni parte superiore dovrebbero adattarsi all'interno dell'area contrassegnata all'interno della membrana. Caricare le piastre di Petri nel plasma.
La membrana e la parte superiore del trattamento al plasma secondo il protocollo scritto. Una volta terminato il ciclo di incollaggio, rimuovere i piatti e posare le parti superiore attivate sulla membrana. Mettere in forno centigrado a 60 gradi per almeno due ore.
Usando un bisturi, tracciare intorno al perimetro della parte superiore incollata per separarlo dal portatore di policarbonato. Una volta tracciata la parte, sbucciare la parte dal policarbonato. Anche la membrana PDMS che si è incollata alla parte superiore dovrebbe staccarsi dal supporto.
Utilizzando le pinzette rimuovere la membrana dalle porte che accedono al canale inferiore. Non lasciare parti della membrana che coprano la porta di accesso. Rimuovere inoltre eventuali detriti o polvere con una pinzetta.
Assemblaggio truciolo. Lato feature verso l'alto, plasma trattare gli assiemi superiore con i fondi. Al microscopio rovesciato, allineare l'assieme superiore con la metà inferiore.
Mettere in forno centigrado a 60 gradi per almeno due ore. Risultati. Il protocollo qui presentato descrive la fabbricazione scalabile di chip d'organo PDMS. Questi dispositivi consentono la coltura di due distinti tipi di tessuto abbondante su una membrana porosa elastica.
I canali PDMS vengono fusi utilizzando stampi stampati in 3D, che accelera la prototipazione di nuovi progetti. I canali principali vengono fusi in stampi sotto compressione contro una guarnizione in poliuretano conforme per produrre componenti con porte stampate. Mentre i componenti del canale inferiore vengono fusi in vassoi e gestiti su supporto scorrevole al microscopio.
Questo approccio di fabbricazione combina la modellizzazione su più scale delle parti in un unico passaggio, risparmiando tempo, migliora la riproducibilità e la tracciabilità e riduce i detriti generati dalla punzonatura delle porte e da più passaggi di taglio. Le membrane porose sono fondamentali per la funzione del chip dell'organo e l'approccio di fabbricazione basato sulla fusione contro wafer di silicio modellati si traduce in membrane di spessore costante e finitura superficiale. La movimentazione tramite supporti in policarbonato consente una maggiore produzione e stoccaggio di lotti.
Il chip per organo assemblato è costituito da due canali di profusione in un pacchetto otticamente trasparente. Nella regione sovrapposta, una membrana PDMS porosa consente l'interazione tessuto-tessuto di metaboliti, proteine, terapie, agenti patogeni e cellule per ricapitolare la funzione del chip d'organo mentre due canali paralleli su entrambi i lati vengono utilizzati per fornire ceppo meccanico, utilizzando l'azionamento ciclico sottovuoto. La porosità della membrana PDMS supporta bio-medicalmente il flusso di metaboliti, fattori di crescita e persino cellule tra la vascu caratteristica e il parenchima dell'organo.
L'apparente permeabilità della membrana è stata determinata utilizzando la di-concentrazione nei canali di uscita con e senza cellule intestinali Caco-2. Gli strati cellulari del chip intestinale forniscono una barriera significativamente maggiore alla permeabilità. Il chip dell'organo può essere azionato utilizzando i canali del vuoto parallelo per applicare quantitativamente e riproducibilmente il carico di deformazione ciclico sulla membrana, e quindi sui tessuti coltivati.
Questo ceppo ciclico combinato con la profusione mediale supporta la differenziazione cellulare per imitare meglio la fisiologia degli organi in vivo, come la formazione di villi nel chip intestinale. Utilizzando il protocollo qui descritto, ora dovresti essere in grado di fabbricare un chip per organo PDMS allungabile.
