Этот протокол продемонстрирует, как дифференцированные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки могут быть посеяны на орган-на-чипе для создания полностью человеческого, персонализированного, микрофлюидного геммозео-мозгового барьера, который может быть использован для прогнозирования проницаемости препарата центральной нервной системы и изучения неврологических расстройств. Используя коммерчески доступный орган-на-чипе, мы продемонстрируем, как любая биологически ориентированная лаборатория может использовать эту технологию для создания персонализированного, микрофлюидного гемового барьера на чипе. Накопление фактических данных свидетельствует о том, что BBB играет определенную роль в неврологических заболеваний путем создания персонализированных чипов BBB, полученных из iPSCs лиц с генетическим неврологическим заболеванием.
Можно будет изучить роль BBB в здоровье и болезни. Этот метод также может быть полезен для фармацевтических компаний, которые могут использовать эту человеческую платформу BBB для проверки на пригодность неврологических препаратов-кандидатов в человеческий мозг. Применение технологий орган-на-чипе обычно требует специальных инженерных навыков.
Использование коммерчески доступных платформ позволяет использовать эту технологию в любой биологически ориентированной лаборатории. Для начала возьмите блюдо, содержащее подготовленные чипсы, в шкаф для биобезопасности. Используя пипетку P200, аккуратно промыть оба канала, добавив 200 микролитров нервной дифференциации среды в вход и потянув жидкость из розетки.
Избегая контакта с портами, тщательно аспирировать избыток капель мультимедиа с поверхности чипа. Аккуратно агитировать подвеску клетки, чтобы обеспечить однородную подвесную клетку. Чтобы посеять iPSC-производные нейронные клетки-предшественники в верхний канал для генерации стороны мозга, добавьте наконечник P200, содержащий от 30 до 100 микролитров клеточной подвески в концентрации от 1 раза 10 до шести клеток на миллилитр в верхний вход канала, и осторожно отпустите кончик из пипетки.
Возьмите пустую трубу P200, угнетайте поршень, вставьте в розетку верхнего канала и осторожно потяните одноклеточную подвеску через кончик. Перенесите чип в микроскоп, чтобы проверить плотность посева и однородное распределение клеток в верхнем канале. После подтверждения плотности клеток при 20%-ном покрытии, сразу же поместите чипы в инкубатор на два часа при 37 градусах по Цельсию.
После этого смойте клетки, которые не прикрепляются, добавляя свежую нейронную дифференциацию среды в вход и потянув жидкость через пипетку из розетки. Держите клетки в статических условиях на 37 градусов по Цельсию с ежедневной нейронной дифференциации средней замены. После того, как iNPCs прикрепили или на следующий день после посева, принести блюдо, содержащее подготовленные чипсы в шкаф биобезопасности.
Аккуратно промыть нижний канал с помощью 200 микролитров эндотелиальной клеточной среды. Избегая контакта с портами, тщательно аспирируют капли избыточной эндотелиальной клеточной среды с поверхности чипа, убедившись, что оставить средний в обоих каналах. Аккуратно агитировать подвеску клетки, чтобы обеспечить однородную подвесную клетку.
Используя пипетку P200, нарисуйте от 30 до 100 микролитров микрососудистой эндотелиальной клеточной подвески мозга iPSC при концентрации от 14 до 20 раз от 10 до шести клеток на миллилитр, и поместите кончик в вход нижнего канала. Наиболее важным шагом для достижения функциональных барьерных свойств является посев микрососудистых эндотелиальных клеток мозга. Очень важно, чтобы семенные клетки при надлежащей плотности, чтобы избежать образования пузырьков для проверки однородного распределения в орган чип.
Угнетайте поршень на пипетке P200 с помощью пустого наконечника, вставьте в розетку нижнего канала и медленно отпустите поршень пипетки, чтобы тщательно вытащить одноклеточную подвеску через нижний канал. Аспирировать лишнюю подвеску ячейки с поверхности чипа. Избегайте прямого контакта с портами входов и выходов, чтобы гарантировать, что подвеска ячейки не будет аспирирована из каналов.
Перенесите чип в микроскоп, чтобы проверить плотность посева. Нижний канал заполнен ячейками без наблюдаемых зазоров между ними. После подтверждения правильной плотности клеток, семян клеток в оставшихся чипов.
Чтобы прикрепить клетки к пористой мембране, которая находится в верхней части нижнего канала, инвертировать каждый чип, и дайте им отдохнуть в колыбели чипа. Поместите небольшой резервуар, содержащий стерильные DPBS внутри 150-миллиметрового блюда, чтобы обеспечить влажность для клеток. Инкубировать чипы при 37 градусах по Цельсию в течение примерно трех часов или до тех пор, пока клетки в нижнем канале не будут прикреплены.
После того, как iPSC-производные мозга микрососудистых эндотелиальных клеток прилагаются, флип чипы обратно в вертикальное положение, чтобы клетки крепления к нижней части нижнего канала. 48 часов после посева микрососудистых эндотелиальных клеток мозга, полученных iPSC, эквилибрировать температуру эндотелиальной клеточной среды путем потепления в 37-градусной водяной бане по Цельсию в течение одного часа. Затем дегазация среды путем инкубации под вакуумной системой фильтрации в течение 15 минут.
Далее, дезинфицировать внешний вид портативного модуля упаковки и лотки с 70%этанола, протрите, и передать их в шкаф биобезопасности. Откройте пакет, и поместите модули в лоток Ориентировать их с резервуарами к задней части лотка. Pipette три миллилитров предварительно equilibrated, теплые средства массовой информации для каждого входного резервуара.
Добавьте эндотелианную среду клеточной культуры к входу в резервуар нижнего канала и среду нейронной дифференциации к верхнему резервуару входного канала верхнего канала. Затем пипетки 300 микролитров предварительно equilibrated, теплые средства массовой информации для каждого резервуара розетки, непосредственно над каждым выходом порта. Поместите до шести портативных модулей на каждый лоток.
Принесите лотки к инкубатору и сползите полностью в модуль культуры с ручкой лотка, обращенной наружу. Выберите и запустите главный цикл на модуле культуры. Закройте дверь инкубатора и позвольте модулю культуры проработать портативные модули примерно на одну минуту.
Цикл грунтовки завершается, когда бар состояния читается готовым. Снимите лоток с модуля культуры и поднесите его в шкаф для биобезопасности. Осмотрите нижнюю часть каждого портативного модуля в кабинете биобезопасности, чтобы убедиться, что портативные модули были успешно загрунтована.
Ищите наличие мелких капель во всех четырех портах. Если какой-либо портативный модуль не показывает капель, повторять простой цикл на этих модулях. Если какие-либо средства массовой информации капали на лоток, который чаще всего происходит в портах розетки, очистить лоток с 70% этанола.
Далее, аккуратно мыть оба канала каждого чипа с теплой, equilibrated ячейки конкретных культур среды для удаления любых возможных пузырьков в канале, и место небольших капель средств массовой информации в верхней части каждого входного и выходного порта. Вставьте чипы с носителями в портативные модули и поместите до шести на каждый лоток. Вставьте лотки в модуль культуры.
Запрограммировать соответствующие условия культуры чипа органа, такие как скорость потока и растяжение, на модуле культуры. Как только цикл регулирования завершен, что занимает около двух часов, начинаются запрограммированные условия. После этого культурный модуль начинает поступать в условиях культуры заданного органа.
Иммуноцитохимия на чипе гемато-мозгового барьера на основе iPSC через семь дней после посева показывает, что сферы эквалайзера дифференцированы в смешанную популяцию нервных клеток в верхнем боковом канале мозга, включая бета-положительные астроциты S100, нестин-положительные нейронные клетки-предшественники, а также GFAP-положительные астроциты и бета III тубулин-положительные нейроны. IPSC-производные микрососудистые эндотелиальные клетки мозга, посеянные в нижнем боковом канале крови, выразили GLUT-1 и PECAM-1. Оценка проницаемости чипа гемового барьера показывает, что чип органа, посеянный с микрососудистыми эндотелиальными клетками мозга и сферами эквалайзера, имел жесткий барьер по сравнению с органными чипами, посеянными только с микрососудистыми эндотелиальными клетками мозга, полученными iPSC.
Органные чипы, посеянные только с сферами эквалайзера, не отображал никаких барьерных свойств. От первоначальной обработки поверхности канала до среднего переключения каждый день, избегайте образования пузырьков в канале. На протяжении всего шага в протоколе, в котором реагент активации поверхности, внеклеточная матрица, или ячейка-содержащая среда должна быть вставлена через каналы, крайне важно тщательно проверить, что пузырь не найден.
Анализ проницаемости может быть выполнен для оценки проницаемости человеческого мозга препаратов-кандидатов. Такой подход может служить для тестирования потенциальных терапевтических средств. Применение чипа BBB на основе iPSC позволяет изучить роль BBB в различных неврологических заболеваниях.
В будущем такая платформа может быть полезна для прогностический, персонализированный приложений медицины.
