O objetivo geral deste protocolo é descrever a fabricação de dispositivos microfluidos de órgãos para recapitulação da funcionalidade do nível do órgão in vitro. Este protocolo descreve uma maneira de fabricar dispositivos lascados de órgãos recapitulando a função de nível de órgão in vitro. Os func, os dispositivos, como estes, são realmente fabricados usando moldes impressos em 3D a partir de uma borracha de silício macia.
Esta borracha nos permite realmente imbuir esses dispositivos com pistas mecânicas que nos permite esticar o tecido como você entrar, digamos, um pulmão ou um intestino. Também adicionamos profusão, que imita o fluxo sanguíneo e o fluxo de outros fluidos corporais dentro dos sistemas de órgãos. Agora juntos, esses dispositivos nos permitem realmente recriar e tentar entender a complexa fisiologia que acontece in vivo.
Mas faça isso in vitro. Então, essencialmente, estamos experimentando em humanos, mas não em pessoas. E por isso é uma maneira muito eficaz de fazer a ponte entre estudos em animais, que são sempre feitos no desenvolvimento pré-clínico da terapêutica, e depois antes dos estudos humanos, que são chamados de ensaios clínicos, onde há um risco muito maior para o ser humano, para a segurança humana.
E assim esses dispositivos ajudam a fazer a ponte entre a divisão e nos permitem desenvolver novas terapêuticas e entender a biologia básica que realmente acontece em sistemas complexos como o humano. Preparação do canal superior. Limpe o lado brilhante de cada peça de poliuretano com etanol e limpe os lenços de quarto.
Coloque o lado brilhante do poliuretano sobre o lado aberto do molde no molde do lugar. Coloque os conjuntos de e poliuretano no gabarito, lado texturizado contra a extremidade do gabarito. Continue a fazer isso até que todos os moldes tenham sido colocados dentro do gabarito.
Aperte o gabarito girando a pega usando uma chave inglesa, até que o espaçamento do gabarito seja de 25 milímetros de largura. Faça um barco de papel alumínio em torno do molde no gabarito do lugar. Despeje PDMS em cada molde até ficar cheio.
Uma vez que todo o gabarito esteja preenchido, coloque o gabarito no desiccador de vácuo. Depois de uma hora, remova do desiccator. E coloque em forno centígrado de 60 graus por pelo menos quatro horas.
Desmonte o gabarito usando uma chave inglesa. Remova as tiras de poliuretano de cada molde. E descarte.
Desmoldou cuidadosamente peças PDMS de seus moldes e as coloca lado a lado. Alinhe a lâmina do raspador de ladrilho no entalhe da aba final. E corte cada extremidade para cingular os componentes superiores.
Armazenar peças finalizadas em pratos quadrados de Petri. Armazene peças em armários de pressão positivos à temperatura ambiente. Preparação do canal inferior.
Despeje 10,5 gramas de PDMS no molde. A pistola de ar pode ser usada muito suavemente para mover o PDMS sobre o espaço. Coloque moldes no desiccator de vácuo.
Depois de uma hora, mova os moldes para um forno centígrado de nível 60 graus. Coloque o molde sobre a mesa em um capô de fluxo laminar. Solte o PDMS da borda do molde.
Segure um canto e retire delicadamente o PDMS da superfície do molde. Quando estiver totalmente removido, inverta e coloque na superfície de trabalho para que os recursos do canal sejam voltados para cima. Corte ao longo das bordas externas com cortador de azulejos.
Com fórceps de remo planas, peças leigas colocam lado para cima na fita para remover quaisquer detritos. Remova parte da fita de embalagem. Arraste a ponta solta da peça através do slide.
A ponta solta vai laminar com o vidro. Características de capa com fita adesiva. Armazene peças em armários de pressão positivos à temperatura ambiente.
Preparação da membrana PDMS. Verifique se os wafers estão livres de PDMS na parte de trás. Coloque cada wafer de membrana nas ranhuras designadas.
Use a seringa de um mL para colocar 09 mL de PDMS no centro de cada matriz de postagem de wafer de membrana. Deixe o PDMS sentar por um mínimo de cinco minutos. Permita que o PDMS se espalhe por todo o poste do wafer de membrana.
Não prossiga para o próximo passo até que pelo menos 75% da matriz de postagem esteja coberta em PDMS. O plasma trata a tira de policarbonato usando as condições descritas no protocolo. Remova a folha de policarbonato da máquina de plasma e use uma tesoura para cortar as folhas de policarbonato em quadrados de 45 milímetros por 45 milímetros.
Coloque o lado tratado de plasma dos quadrados de policarbonato sobre o PDMS, centrado no wafer de membrana. Coloque espaçador PDMS no centro do quadrado de policarbonato. Em seguida, coloque policarbonato texturizado pré-cortado.
Insira bandejas para que a bandeja três esteja na parte de trás, a bandeja dois esteja no meio e a bandeja uma esteja na frente. A bandeja um tem um entalhe para alinhamento. Abra a válvula de pressão de saída e abra lentamente a válvula de pressão de entrada.
Isto é para que os quatro quilos de força seja gradualmente aplicado a cada wafer de membrana, em oposição à instantaneamente que pode quebrar os wafers. Ligue o interruptor AMF para iniciar o ciclo de cura. Em seguida, feche a válvula de pressão de entrada e abra as válvulas de pressão de saída para liberar a pressão dos cilindros de ar.
Remova as bandejas e leve-as para o capô de fluxo laminar. Retire cuidadosamente o policarbonato texturizado. Remova cuidadosamente o espaçador PDMS.
Inspecione a membrana PDMS em busca de áreas com furos. Use um marcador para traçar o contorno da área do furo. Também marque quaisquer orifícios ou defeitos nas membranas.
Este é um exemplo de uma membrana não marcada e marcada. Usando pinças de manuseio de wafer, solte wafers da bandeja. Retire cada membrana do wafer e coloque na placa de Petri.
A membrana PDMS será desmoldada do wafer e será ligada ao apoio de policarbonato. Armazene peças em armários de pressão positivos à temperatura ambiente. Montagem superior e preparação.
Usando fita adesiva fosca, limpe as membranas PDMS, bem como o interior da placa de Petri para remover detritos. Grave completamente o lado do recurso de cada topo de canal alto para remover detritos. Coloque tops na placa de Petri com membrana PDMS.
Esteja ciente de que algumas membranas podem tomar uma ou duas partes superiores. Os principais canais de cada parte superior devem caber dentro da área marcada dentro da membrana. Coloque as placas de Petri no plasma.
Membrana de tratamento de plasma e topo de acordo com o protocolo escrito. Uma vez terminado o ciclo de ligação, remova os pratos e coloque as partes superiores ativadas na membrana. Coloque em forno centígrado de 60 graus por pelo menos duas horas.
Usando um bisturi, rastreie o perímetro da parte superior ligada para separá-lo do portador de policarbonato. Uma vez que a peça é rastreada, retire a parte superior do policarbonato. A membrana PDMS que se uniu ao topo deve descascar do portador também.
O uso de pinças remove a membrana das portas que acessam o canal inferior. Não deixe nenhuma parte da membrana que cubra a porta de acesso. Além disso, remova quaisquer detritos ou poeira com pinças.
Montagem de chips. Característica lado para cima, plasma tratar montagens superiores com fundos. Sob um microscópio invertido, alinhe o conjunto superior com a metade inferior.
Coloque em forno centígrado de 60 graus por pelo menos duas horas. Resultados. O protocolo aqui apresentado descreve a fabricação escalável de chips de órgãos PDMS. Estes dispositivos permitem a cultura de dois tipos distintos de tecido profuso em uma membrana porosa elástica.
Os canais PDMS são lançados usando moldes impressos em 3D, o que acelera a prototipagem de novos designs. Os canais superiores são lançados em moldes sob compressão contra uma junta de poliuretano compatível para produzir componentes com portas moldadas. Enquanto os componentes inferiores do canal são lançados em bandejas e manuseados no apoio de slides do microscópio.
Esta abordagem de fabricação combina a padronização em várias escalas das peças em um único passo, o que economiza tempo, melhora a reprodutibilidade e a rastreabilidade e reduz os detritos gerados por perfuração da porta e múltiplas etapas de corte. As membranas porosas são críticas para a função do chip de órgão, e a abordagem de fabricação baseada na fundição contra wafers de silício padronizados resulta em membranas de espessura consistente e acabamento superficial. O manuseio via transportadores de policarbonato permite maior produção e armazenamento em lote.
O chip de órgão montado consiste em dois canais de profusão em um pacote opticamente transparente. Na região sobreposta, uma membrana PDMS porosa permite a interação tecido-tecido de metabólitos, proteínas, terapêuticas, patógenos e células para recapitular a função do chip de órgão, enquanto dois canais paralelos de cada lado são usados para fornecer tensão mecânica, usando atolação cíclica do vácuo. A porosidade da membrana PDMS suporta biomeiadamente o fluxo de metabólitos, fatores de crescimento e até células entre a vasculatura e o órgão parenchyma.
A aparente permeabilidade da membrana foi determinada utilizando-se a concentração di nos canais de saída com e sem células intestinais caco-2. As camadas de células do chip intestinal fornecem uma barreira significativamente maior à permeabilidade. O chip de órgão pode ser acionado usando os canais de vácuo paralelos para aplicar quantitativamente e reproduibavelmente o carregamento de cepa cíclica na membrana e, portanto, os tecidos cultivados.
Esta cepa cíclica combinada com a profusão de mídia suporta diferenciação celular para melhor imitar a fisiologia de órgãos in vivo, como a formação de villi no chip intestinal. Usando o protocolo descrito aqui, agora você deve ser capaz de fabricar um chip de órgão PDMS elástico.
