JoVE Journal

Immunology and Infection

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove

live

Speed

×

MEDIA_ELEMENT_ERROR: Format error

Адгезию динамической Assay для функционального анализа антиадгезионное терапии в воспалительных заболеваний кишечника

Транскрипт

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы основной иммунобиологии и воспалительных заболеваний кишечника исследований в отношении адгезии каскад иммунных клеток, необходимых для самонаведения к периферических органов. Основным преимуществом этой техники является то, что это удобный и простой подход для ответа на функциональные вопросы в контексте клеточной адгезии в условиях потока. Хотя этот метод был разработан для изучения механизма клеточных poietic анти-интегрин антител при воспалительных заболеваниях кишечника, он может быть изменен для анализа аналогичных проблем в других воспалительных заболеваний.

Начните с растяжения кусок резиновой трубки на одной стороне с маленькими ножницами, чтобы вставить прямоугольный капилляр примерно 0,5 сантиметров в трубку. Затем запечатай связь с парафиновой пленкой. Пальто капилляр с 20 микролитров addressin интереса и печать стороны не подключены к трубе с пластиковой парафиновой пленкой, по крайней мере один час инкубации при 37 градусов по Цельсию.

В конце инкубации снимите пластиковую парафиновую пленку и дайте жидкости вымочить капилляр на бумажное полотенце, чтобы опорожнить трубы. Затем блокируйте капилляры с 20 микролитров блокирующего раствора, по крайней мере один час при 37 градусах по Цельсию. Очень важно применять блокировку к капилляру сразу после удаления покрытия, чтобы избежать высыхания капилляров, так как это может ухудшить функциональность закодированных белков.

В то время как капилляр блокируется, добавить 18 миллилитров антикоагулярной всей человеческой крови из 50 миллилитров трубки и разбавить кровь до общего объема 35 миллилитров с PBS. Слой 10 миллилитров градиентной среды плотности под раствором крови и изолировать периферические моноядерные кровяные клетки крови по плотности градиентной центрифугации. В конце отделения перенесите периферические моноядерные клетки крови из интерфейса градиентной среды плотности в новую 50-миллилитровую трубку.

И довести общий объем в трубке до 50 миллилитров со свежим PBS. После центрифугации, повторно гранулы в 10 миллилитров свежего PBS для подсчета и пятно клеток с подходящим красителем отслеживания клеток в соответствии с инструкциями производителя. В конце инкубации окрашивания, собирать клетки центрифугации и повторно гранулы в 1,5 раза 10 до шести клеток на миллилитр полной RPMI средней концентрации.

Затем семя один миллилитр клеток в столько колодцев 48 хорошо пластины, как Есть условия. И добавить соответствующий объем анти-интегрин антитела к соответствующим скважинам в течение одного часа инкубации при 37 градусах по Цельсию. Далее используйте P1000 пипетки для повторного перерасхода клеток несколько раз, прежде чем передавать клетки в отдельные две миллилитровые трубки.

Промыть каждый хорошо с одним миллилитров PBS и бассейн моет в соответствующих двух миллилитров труб. После подсчета, гранулы клеток центрифугации и повторно клетки в соответствующем объеме адгезии буфера, чтобы получить 1,5 раза десять-шестой клетки на миллилитр суспензии. Затем добавьте соответствующий объем хлорида марганца в каждую трубку в одну миллимолярдную окончательную концентрацию.

Когда клетки будут готовы, включите микроскоп и выберите соответствующие фильтры и лазеры, объективный и режим приобретения. Удалите пластиковую парафиновую пленку с кончика капилляра и используйте ножницы, чтобы растянуть пятисимметровый кусок резиновой трубки, чтобы капилляр был подключен к меньшей трубке. Печать связи между капилляром и трубкой с пластиковой парафиновой пленкой.

И смонтировать капилляр на подносе фиксации. Поместите лоток на поднос держатель микроскопа, чтобы капилляр находится в центре внимания. И вставьте резиновые трубки в соответствующую выемку перистального насоса.

Поместите непривязанный конец трубки в первую пробную трубку, содержащую подвесную клетку. И вставьте короткую трубку на другой стороне капилляра в 15 миллилитровую трубку, чтобы собрать поток через. Пусть трубки заполнить на 500 микролитров в минуту скорость потока, пока подвеска клетки почти достигает капилляров.

Затем дайте капилляру заполнить со скоростью потока 100 микролитров в минуту. Когда капилляр заполнен клетками, отрегулируйте скорость потока до 10 микролитров в минуту и захватить покадровой промежуток изображения клеток, медленно движущихся через капилляр вдоль внутренней части стенки с покрытием адресина каждые две секунды в общей сложности три минуты. После того, как подвеска клетки достигает внутренней части капилляра, очень важно, чтобы избежать прерывания потока, как это приведет к статической интегрин addressin взаимодействия потенциально смещения измерения.

Перед отбрасывания потока весь капилляр через окуляр микроскопа, чтобы убедиться, что раздел наблюдается на экране является репрезентативным. Освободите трубку от насоса и дайте оставшейся жидкости бежать обратно в двухмилитровую трубку. Затем отключите капилляр и трубки от лотка фиксации и изображение следующего капилляра, как только что продемонстрировано.

Чтобы оценить записи промежуток времени, откройте первую последовательность в соответствующем программном обеспечении анализа и экспортировать первые и последние три изображения в качестве файлов TIFF. Откройте три начинающих изображения в ImageJ и выберите изображение, тип и 32-битный для преобразования изображений в 32-битные. Затем выберите каналы изображения, цвета и слияния, чтобы объединить изображения в одно изображение и преобразовать композитное изображение в RGB для сохранения в качестве файла TIFF.

После преобразования последних трех изображений таким же образом, подсчитайте белые клетки, видимые в начале, и закончив композитные изображения. И вычесть количество белых клеток в начале изображения из числа белых клеток в конечном изображении. Перфузия капилляров, покрытых ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1, но не Isotype Fc химера с человеческими ПКМК приводит к заметной адгезии, когда один из трех адресов присутствует.

В отличие от этого, ингибирование интегрин addressin взаимодействий с использованием нейтрализации антител, как правило, приводит к заметному снижению динамической адгезии, которая отсутствует при добавлении антитела контроля изотипа. Кроме того, лечение CD4 человеческих Т-клеток с конкретными хемокинами приводит к увеличению адгезии адресинов по сравнению с необработанными клетками человека. При попытке этой процедуры, очень важно помнить, что различные факторы способствуют динамической адгезии клеток in vivo, которые не могут быть полностью резюмированы в этом анализе.

Тем не менее, можно скорректировать анализ для решения очень сложных вопросов. Для того, чтобы решить дополнительные вопросы о дифференциальной адгезии поведение тестирования типов клеток, можно также выполнить конкурентные анализы адгезии с различными типами клеток помечены с различными красителями отслеживания клеток. После его развития, этот метод позволил нам изучить последствия различных анти-интегрин антител, используемых или в настоящее время в разработке для лечения воспалительных заболеваний кишечника.

Динамический адгезии иммунокомпетентных клеток к стенке сосуда является необходимым условием для кишечника самонаведения. Здесь мы представляем протокол для функциональной в vitro пробирного анализа воздействия антител анти Интегрин, chemokines или других факторов на динамических клеточной адгезии клеток человека с помощью addressin покрытием капилляров.

Смотреть дополнительные видео

Главы в этом видео

0:04

Title

0:45

Capillary and Cell Preparation

3:54

Live Cell Imaging of Dynamic Adhesion and Evaluation

6:52

Results: Representative Human PBMC Adherence Assessment

7:33

Conclusion

Похожие видео

article

10:47

Использование изображений Биолюминесцентный по расследованию синергизм между Пневмококк И вируса гриппа А в младенческой Мыши

16.7K Views

article

05:57

In Vitro Пробирной бактериальной адгезии на эпителиальных клетках млекопитающих

25.3K Views

article

13:28

Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

15.5K Views

article

14:43

Дифференцируя функциональной роли экспрессии генов от иммунной и не-иммунных клеток в мышь колит трансплантацией костного мозга

17.3K Views

article

09:52

Генетические манипуляции

16.9K Views

article

11:22

Количественный

17.0K Views

article

12:42

Нейтрофилов человека Проточная камера Адгезия Анализ

16.7K Views

article

09:14

Статический Адгезия Анализ по изучению активации интегрина в Т-лимфоцитов

15.9K Views

article

07:40

Анализ адгезии при сдвиге стресса для изучения Т-лимфоцитами взаимодействий молекул адгезии

8.4K Views

article

12:50

Скрининг Assays характеризовать Роман эндотелиальной регуляторы, участвующих в воспалительной реакции

6.5K Views

Мы используем файлы cookie для улучшения качества работы на нашем веб-сайте.

Продолжая пользоваться нашим веб-сайтом или нажимая кнопку «Продолжить», вы соглашаетесь принять наши файлы cookie.

Подробнее