Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés de l’immunobiologie de base et de la recherche inflammatoire sur les maladies intestinales concernant la cascade d’adhérence des cellules immunitaires nécessaires pour l’homing aux organes périphériques. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une approche pratique et simple pour répondre à des questions fonctionnelles dans le contexte de l’adhérence cellulaire dans des conditions d’écoulement. Bien que cette méthode ait été développée pour explorer le mécanisme des anticorps anti-intégrine poietic de cellules dans les maladies intestinales inflammatoires, elle peut être modifiée pour analyser des issues semblables dans d’autres arrangements inflammatoires de maladie.
Commencez par étirer un morceau de tube en caoutchouc d’un côté avec de petits ciseaux pour permettre l’insertion d’un capillaire rectangulaire d’environ 0,5 centimètre dans le tube. Puis sceller la connexion avec le film de paraffine. Enduire le capillaire de 20 microlitres de l’adresse d’intérêt et sceller le côté non relié au tube avec du film de paraffine en plastique pendant au moins une heure d’incubation à 37 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, retirer le film de paraffine en plastique et laisser tremper le liquide du capillaire sur une serviette en papier pour vider le tube. Puis bloquer capillaires avec 20 microlitres de solution de blocage pendant au moins une heure à 37 degrés Celsius. Il est très important d’appliquer le blocage sur le capillaire directement après avoir enlevé le revêtement pour éviter le séchage du capillaire car cela peut nuire à la fonctionnalité des protéines codées.
Pendant que le capillaire est bloqué, ajouter 18 millilitres de sang humain entier anticoagulé à partir d’un tube de 50 millilitres et diluer le sang à un volume total de 35 millilitres avec PBS. Couche 10 millilitres de milieu de gradient de densité sous la solution sanguine et isoler les cellules sanguines mononucléaires périphériques du sang par centrifugation gradient de densité. À la fin de la séparation, transférer les cellules mononucléaires périphériques du sang de l’interface du milieu de gradient de densité à un nouveau tube de 50 millilitres.
Et porter le volume total dans le tube jusqu’à 50 millilitres avec PBS frais. Après centrifugation, resuspendez la pastille en 10 millilitres de PBS frais pour compter et tacher les cellules avec un colorant de suivi cellulaire approprié selon les instructions du fabricant. À la fin de l’incubation de coloration, recueillir les cellules par centrifugation et resuspendre la pastille à un 1,5 fois 10 à six cellules par millilitre de concentration moyenne complète RPMI.
Puis ensemencer un millilitre de cellules dans autant de puits d’une plaque de 48 puits qu’il ya des conditions. Et ajouter le volume approprié d’anticorps anti-intégrine aux puits appropriés pour une incubation d’une heure à 37 degrés Celsius. Ensuite, utilisez une pipette P1000 pour résuspendre les cellules plusieurs fois avant de transférer les cellules dans des tubes individuels de deux millilitres.
Rincez chaque puits avec un millilitre de PBS et mettre les lavages en commun dans les tubes de deux millilitres appropriés. Après comptage, pelleter les cellules par centrifugation et réutilisé les cellules dans le volume approprié de tampon d’adhérence pour obtenir 1,5 fois dix à la sixième cellules par millilitre suspensions. Ajoutez ensuite le volume approprié de chlorure de manganèse à chaque tube à une concentration finale d’un millimlaire.
Lorsque les cellules sont prêtes, allumez le microscope et sélectionnez les filtres et lasers appropriés, le mode objectif et le mode d’acquisition. Retirez le film de paraffine en plastique de l’extrémité du capillaire et utilisez des ciseaux pour étirer un morceau de tube en caoutchouc de cinq centimètres pour permettre au capillaire d’être relié au tube plus petit. Sceller la connexion entre le capillaire et le tube avec du film de paraffine en plastique.
Et monter le capillaire sur un plateau de fixation. Placez le plateau sur le support du plateau du microscope afin que le capillaire soit au point. Et insérez le tube en caoutchouc dans l’encoche correspondante de la pompe périssaliste.
Placez l’extrémité non attachée du tube dans le premier tube d’échantillon contenant la suspension cellulaire. Et insérez le tube court de l’autre côté du capillaire dans un tube de 15 millilitres pour recueillir le flux à travers. Laissez le tube se remplir à un débit de 500 microlitres par minute jusqu’à ce que la suspension cellulaire atteigne presque le capillaire.
Ensuite, laissez le capillaire se remplir à un débit de 100 microlitres par minute. Lorsque le capillaire est rempli de cellules, ajustez le débit à 10 microlitres par minute et capturez les images en accéléré des cellules se déplaçant lentement à travers le capillaire le long de l’intérieur de la paroi enduite d’adresse toutes les deux secondes pendant un total de trois minutes. Une fois que la suspension cellulaire atteint l’intérieur du capillaire, il est essentiel d’éviter toute interruption du flux car cela conduira à l’interaction statique integrin addressin potentiellement biaiser la mesure.
Avant de jeter le flux tout capillaire à travers l’oculaire du microscope pour s’assurer que la section observée sur l’écran est représentative. Libérez le tube de la pompe et laissez le liquide restant revenir dans le tube de deux millilitres. Puis déconnecter le capillaire et le tube du plateau de fixation et l’image du capillaire suivant comme il vient de le démontrer.
Pour évaluer les enregistrements time lapse, ouvrez la première séquence dans le logiciel d’analyse approprié et exportez les trois premières et dernières images sous forme de fichiers TIFF. Ouvrez les trois images de début dans ImageJ et sélectionnez l’image, le type et le 32-bit pour convertir les images en 32 bits. Sélectionnez ensuite des canaux d’image, de couleur et de fusion pour fusionner les images en une seule image et convertir l’image composite en RVB pour l’enregistrement en tant que fichier TIFF.
Après avoir converti les trois dernières images de la même manière, comptez les globules blancs visibles au début et à la fin des images composites. Et soustrayez le nombre de globules blancs dans l’image de début du nombre de globules blancs dans l’image finale. La perfusion de capillaires recouverts d’ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1, mais pas isotype Fc chimère avec pbmcs humains conduit à l’adhérence marquée lorsque l’un des trois addressins est présent.
En revanche, l’inhibition des interactions d’adresse d’intégrine utilisant des anticorps neutralisants mène typiquement à une diminution marquée de l’adhérence dynamique qui est absente quand des anticorps de contrôle d’isotype sont ajoutés. En outre, le traitement des lymphocytes T humains CD4 avec des chimiokines spécifiques conduit à une adhérence accrue aux addressins par rapport aux cellules humaines non traitées. Tout en essayant cette procédure, il est très important de se rappeler que divers facteurs contribuent à l’adhérence cellulaire dynamique in vivo qui ne peut pas être complètement récapitulée dans cet essai.
Toutefois, il est possible d’ajuster le test pour répondre à des questions très complexes. Afin de répondre à d’autres questions sur le comportement différentiel d’adhérence des types de cellules d’essai, il est également possible d’effectuer des tests d’adhérence compétitifs avec différents types de cellules étiquetés avec différents teintures de suivi cellulaire. Après son développement, cette technique nous a permis d’explorer les effets des différents anticorps anti-intégrine utilisés ou actuellement en développement pour le traitement des maladies inflammatoires de l’intestin.
