Bu yöntem, periferik organlara homing için gerekli bağışıklık hücrelerinin adezyon kaskad ile ilgili temel immünobiyoloji ve inflamatuar barsak hastalığı araştırma anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, akış koşullarında hücre yapışması bağlamında fonksiyonel soruları yanıtlamak için kullanışlı ve basit bir yaklaşım olmasıdır. Bu yöntem inflamatuar barsak hastalıklarında hücre poietik anti-integrin antikorlarının mekanizmasını araştırmak için geliştirilmiş olsa da, diğer inflamatuar hastalık ortamlarında benzer sorunları analiz etmek için değiştirilebilir.
Bir tarafta küçük makaslarla bir parça kauçuk boru gererek başlayın ve tüpe yaklaşık 0,5 santimetre lik dikdörtgen bir kılcal damar ın yerleştirilmesine izin verin. Sonra parafin film ile bağlantı mühür. Kap20 mikrolitre ilgi adresleri ile kılcal ve plastik parafin film ile boru bağlı olmayan tarafı mühür en az bir saat kuluçka için 37 santigrat derece.
Kuluçka sonunda, plastik parafin film çıkarın ve tüp boşaltmak için bir kağıt havlu üzerine kılcal dışarı ıslatın sıvı sağlar. Daha sonra 37 santigrat derecede en az bir saat boyunca 20 mikrolitre bloklama çözeltisi ile kılcal damarı kesin. Bu kodlanmış proteinlerin işlevselliğini bozabilir gibi kılcal kurumasını önlemek için kaplama çıkardıktan sonra doğrudan kılcal damara tıkanıklık uygulamak çok önemlidir.
Kılcal damar lar tıkanırken, 50 mililitrelik bir tüpten 18 mililitre antikoagüle tam insan kanı ekleyin ve kanı PBS ile toplam 35 mililitrelik bir hacimle seyreltin. Kan çözeltisi altında yoğunluk gradyan orta Katman 10 mililitre ve yoğunluk gradyan santrifüj tarafından periferik kan mononükleer kan hücrelerini izole. Ayırma sonunda, yoğunluk gradyan ortamının arabiriminden periferik kan mononükleer hücrelerini 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.
Ve taze PBS ile 50 mililitreye kadar tüp toplam hacmi getirmek. Santrifüjden sonra, 10 mililitre taze PBS'deki peleti, üreticinin talimatlarına göre uygun bir hücre izleme boyası ile saymak ve lekelemek için yeniden askıya alın. Boyama kuluçka sonunda, santrifüj ile hücreleri toplamak ve tam RPMI orta konsantrasyonmililitre başına altı hücre için 1,5 kez 10 pelet resuspend.
Sonra 48 kuyu plaka gibi birçok kuyuiçine hücrelerin bir mililitre tohum koşulları vardır. Ve 37 santigrat derecede bir saatlik kuluçka için uygun kuyulara uygun anti-integrin antikor hacmiekleyin. Daha sonra hücreleri tek tek iki mililitrelik tüplere aktarmadan önce hücreleri birkaç kez yeniden askıya almak için bir P1000 pipet kullanın.
Her birini bir mililitre PBS ile yıkın ve yıkamayı uygun iki mililitrelik tüplerde havuzlayın. Sayma sonra, santrifüj ile hücreleri pelet ve mililitre süspansiyonlar başına altıncı hücrelere 1,5 kez on elde etmek için yapışma tampon uygun hacimde hücreleri resuspened. Sonra bir milimolar son konsantrasyoniçin her tüp için manganez klorür uygun hacmi ekleyin.
Hücreler hazır olduğunda, mikroskobu açın ve uygun filtreleri ve lazerleri, nesnel ve edinme modunu seçin. Kılcal damar ın ucundan plastik parafin film çıkarın ve kılcal küçük tüp bağlı izin vermek için kauçuk boru beş santimetrelik bir parça germek için makas kullanın. Kılcal damar ve tüp arasındaki bağlantıyı plastik parafin filmile kapatın.
Ve kılcal damarı bir sabitleme tepsisine monte edin. Kapiller odak olacak şekilde tepsiyi mikroskobun tepsi tutucuya yerleştirin. Ve peristaltik pompa nın ilgili çentik içine kauçuk boru takın.
Tüpün bekar ucunu hücre süspansiyonuna içeren ilk numune tüpüne yerleştirin. Ve kapiller diğer tarafında kısa tüp ekleyin 15 mililitrelik tüp içine akış toplamak için. Hücre süspansiyonu neredeyse kılcal damara ulaşana kadar tüpün dakikada 500 mikrolitre akış hızıyla dolmasına izin verin.
Sonra kılcal damar dakikada 100 mikrolitre bir akış hızında doldurmak sağlar. Kılcal damar hücrelerle dolduğunda, akış hızını dakikada 10 mikrolitreye ayarlayın ve toplam üç dakika boyunca her iki saniyede bir, kaplanmış duvarın içindeki adresin iç kısmı boyunca yavaşça hareket eden hücrelerin zaman atlamalı görüntülerini yakalayın. Hücre süspansiyonu kılcal damarın içine ulaştığında, akışta herhangi bir kesinti olmasını önlemek önemlidir, çünkü bu, etkileşimde statik integrin adresine yol açacaktır.
Ekranda gözlenen bölümün temsili olduğundan emin olmak için tüm kılcal damarı mikroskop un merceğine atmadan önce. Pompadan tüp serbest ve kalan sıvı iki mililitrelik tüp içine geri çalışmasına izin. Daha sonra kılcal damarı ve tüpü fiksasyon tepsisinden çıkarın ve bir sonraki kılcal damarı az önce gösterildiği gibi görüntüleyin.
Zaman atlamalı kayıtları değerlendirmek için, uygun analiz yazılımındaki ilk sırayı açın ve ilk ve son üç görüntüyü TIFF dosyaları olarak dışa aktarın. ImageJ'deki üç başlangıç görüntüsünü açın ve görüntüleri 32 bit'e dönüştürmek için görüntüyü, yazıyı ve 32 bit'i seçin. Ardından, görüntüleri tek bir görüntüde birleştirmek için görüntü, renk ve birleştirme kanallarını seçin ve tiff dosyası olarak kaydetmek için bileşik görüntüyü RGB'ye dönüştürün.
Son üç görüntüyü aynı şekilde dönüştürdükten sonra, bileşik görüntülerin başında ve sonunda görünen beyaz hücreleri sayın. Ve başlangıç görüntüsündeki beyaz hücrelerin sayısını, bitiş görüntüsündeki beyaz hücrelerin sayısından çıkarın. ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1 ile kaplanmış ancak insan PBMC'leri ile İzotip Fc chimera ile kaplanmış kılcal damarların perfüzyonu, üç adresten biri mevcut olduğunda belirgin yapışmaya yol açar.
Buna karşılık, nötralize antikorlar kullanarak integrin adreslerinin inhibisyonu genellikle iyotip kontrol antikorları eklendiğinde olmayan dinamik yapışma belirgin bir azalmaya yol açar. Ayrıca, cd4 insan T hücrelerinin belirli kemokinler ile tedavisi tedavi edilmeyen insan hücrelerine göre adresinler için artan bir yapışma yol açar. Bu yordamı denerken, çeşitli faktörlerin bu istozda tamamen özetlenemez in vivo dinamik hücre adezyonuna katkıda bulunmak çok önemlidir.
Ancak, çok karmaşık sorulara hitap etmek için tsay ayarlamak mümkündür. Hücre türlerinin diferansiyel yapışma davranışı ile ilgili ek soruları ele almak için, farklı hücre izleme boyaları ile etiketlenmiş farklı hücre türleri ile rekabetçi yapışma testleri yapmak da mümkündür. Bu teknik, geliştirildikten sonra inflamatuar barsak hastalıklarının tedavisinde kullanılan veya şu anda geliştirilmekte olan farklı anti-integrin antikorlarının etkilerini keşfetmemizi sağladı.
