Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в оценке терапевтических эффектов препарата в области эндометриоза, таких как влияние антиандрогенных соединений на размер эндометриотических поражений. Основным преимуществом этого метода является то, что эффекты конкретных препаратов могут быть оценены в животных моделях эндометриоза в режиме реального времени, а не в конечной точке. Демонстрация процедуры будет Джессика Мартинес, который является техником из моей лаборатории, а также Вивиана Бисбал и Нереа Марин, которые являются ветеринарами из Centro de Investigacion Principe Фелипе и которые являются близкими сотрудниками с нашей командой.
За два-три дня до операции по имплантации перенесите промытые, здоровые фрагменты биопсии эндометриальной ткани в 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую полную среду, и используйте скальпели, чтобы измельчить ткань на кусочки в 5-10 миллиметров. Используя микропипюту, добавьте от 30 до 50 капель микролитров DMEM по дну нового 10-сантиметрового блюда культуры, оставляя достаточно места между каждой каплей, чтобы они не соедились друг с другом. Когда все капли были помещены, используйте шприц иглы разместить один кусок фрагмента биопсии ткани в каждой капли.
Далее добавьте от 100 до 200 микролитров свежеприготовленных адено-мчерри к одной скважине из 96 скважин на фрагмент ткани, плюс три скважины с аденовирусным DMEM в качестве отрицательного контроля. Затем используйте иглу для передачи одного образца ткани в каждую колодец адено-мчерри раствора для ночной инкубации при 37 градусах по Цельсию и 5%CO2. На следующее утро поместите пластину на стадии флуоресценции микроскопа и использовать 568 нанометровый лазер, чтобы проверить фрагменты для оптимальной маркировки.
Использование соответствующего разбавления инфекционного аденовируса mCherry является ключевым для эффективной маркировки тканей. Таким образом, чтобы определить соответствующую концентрацию, несколько для разбавления mCherry, для каждого отдельного эксперимента, должны быть оценены. Затем перенесите самые блестящие фрагменты в отдельные скважины новой пластины 96 скважин, содержащей свежую, полную среду.
По крайней мере, через семь дней после оофорэктомии, декант эндометрия фрагменты ткани в чашку Петри, и подтвердить отсутствие реакции на щипать в анестезированной, oophorectomized животных. С помощью мыши в положении на спине дезинфицировать брюшной полости и сделать 1,5 сантиметр продольный разрез в брюшной полости. Отделить кожу от мышцы и сделать второй 1,5 сантиметра разрез в мышце для доступа к брюшной полости.
Держа левый край брюшной мышечной стенки с мини-типсами, сложите мышцу, чтобы разоблачить внутреннее лицо брюшной полости на внешней стороне животного. Используйте мини-пинцет, чтобы кратко замочить один эндометриальный имплантат в n-бутил эстер цианоакрилат клей и прикрепить фрагмент к брюшной полности. Когда клей высохнет, поместите второй имплантат на контралатеральной стороне брюшной полности, как только что продемонстрировано.
Используйте абсорбируемый 6-0 шов, чтобы закрыть мышечный слой и неаспасаемый 6-0 шов, чтобы закрыть кожу. Затем очистите разрез кожи антисептическим раствором и поместите животное в зону восстановления с контролем до полного уми положении. Для флуоресцентной визуализации имплантированных фрагментов тканей через 24-48 часов после операции по имплантации включите систему визуализации in-vivo, инициализируйте программное обеспечение и позвольте камере CCD остыть в течение нескольких минут.
После того, как инструмент будет готов место первой обезболивающей мыши в клетку системы визуализации in-vivo, в положении на спине, с головой внутри трубоушки подключен к анестезии машины, и закрыть крышку. Затем нажмите приобрести и сохранить пять полученных изображений. Для количественной оценки флуоресценции in-vivo в соответствующем программном обеспечении для анализа изображений щелкните просмотр и выберите несмешанный файл, представляющий интерес для анализа.
Появится новое окно. Нажмите добавить в список, чтобы включить все несмешаемые файлы от каждого животного в разные моменты времени и нажмите нагрузки в группе. Все изображения должны отображаться в одной последовательности.
В окне палитры инструментов, неизбранный отдельный флажок масштаба, чтобы настроить все изображения в той же шкале, и дважды нажмите на одно изображение последовательности. Чтобы создать область интереса, в области интересов инструменты выберите контур и авто один вариант, и нажмите на форму круга, чтобы поместить круг в центре флуоресцентного сигнала. Нажмите создать, чтобы создать область интереса и скопировать и вставить область интереса на фоне, где нет сигнала.
Затем нажмите измерить области, представляющие интерес, и выберите все для отображения значений для интенсивности флуоресценции каждого региона и скопировать и вставить эти значения в электронную таблицу. Маркировка фрагментов эндометрия достигается инфекцией аденовирусом, разработанным для экспрессии mCherry, белка, который испускает флуоресценцию в ближнем инфракрасном разделе, который значительно более надежный, чем неинденциальная аутофторесценция эндометрия. Во время мониторинга, в дополнение к эталонной длине волны для mCherry, флуоресцентные изображения принимаются с различными парами возбуждения выбросов длины волны фильтров.
Для определения характерных флуоресцентных профилей излучения тканей поражений из фона, а также аутофторесценции, испускаемой тканями хозяина, мониторинг изображения, содержащие сырые флуоресценции, испускаемые животными в течение каждого времени точки собираются вместе, ненормальные, в одном файле. Далее флуоресценция не смешивается, нормализуется и представляется как ложное цветное изображение, а области интересов, соответствующие конкретным легионным и фоновым сигналам, автоматически распознаются программой и количественно. Фоновая область сигнализации интересов вычитается из области интересов легиона сигнализации.
И результаты интенсивности в каждой точке времени нормализуются по отношению к точке времени, в которой интенсивность максимальна. После нескольких недель мониторинга жизнеспособные имплантаты могут быть восстановлены для дальнейшего анализа ниже по течению. При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы выбрать концентрацию Ad-mCherry, который обеспечивает самый блестящий сигнал без ущерба для жизнеспособности ткани.
После этой процедуры, поражения могут быть восстановлены и использованы для изучения дополнительных отличительных параметров. Эта процедура оптимизирована для неинвазивного мониторинга поражений ксенотрансплантата человеческого эндометриоза. Тем не менее, он может быть легко адаптироваться для оценки воздействия конкретных препаратов, представляющих интерес на местах ксенотрансплантата в режиме реального времени.
