この方法は、子宮内膜症の分野における治療薬の効果(子宮内膜病変の大きさに対する抗アンドロゲン化合物の影響など)を評価する際の重要な質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、特定の薬物の効果がエンドポイントではなくリアルタイムで子宮内膜症の動物モデルで評価することができるということです。この手順を実証するのは、私の研究室の技術者であるジェシカ・マルティネスと、セントロ・デ・インベスティガシオン・プリンシペ・フェリペの獣医師であり、私たちのチームとの緊密な協力者であるヴィヴィアナ・ビスバルとネリア・マリンです。
インプラント手術の2〜3日前に、すすいで健康な子宮内膜組織生検断片を完全な媒体を含む10センチメートルのペトリ皿に移し、メスを使用して組織を5〜10ミリメートル立方体にミンチする。マイクロピペットを使用して、新しい10センチメートル培養皿の底に30〜50マイクロリットルのDMEMを加え、各滴の間に十分なスペースを残して、互いに接触しないようにします。すべての滴が置かれたら、注射針を使用して、各滴に生検組織断片の単一片を配置する。
次に、組織片あたり96ウェルプレートの1つのウェルに、さらにネガティブコントロールとしてアデノウイルスフリーDMEMを備えた3つのウェルに、作りたてのアデノmCherryを100〜200マイクロリットル加えます。その後、針を使用して1つの組織サンプルをadeno-mCherry溶液の各ウェルに移し、摂氏37度と5%CO2で一晩インキュベーションします。翌朝、プレートを蛍光顕微鏡ステージに置き、568ナノメートルレーザーを使用して、最適な標識のために断片をチェックします。
感染mCherryアデノウイルスの適切な希釈を使用することは、組織の効率的な標識のための鍵です。そこで適切な濃度を決定するために、mCherry希釈に対してのいくつかは、個々の実験ごとに、評価されなければならない。その後、新鮮な、完全な媒体を含む新しい96ウェルプレートの個々の井戸に最も華麗な断片を転送します。
子宮摘出術の少なくとも7日後、子宮内膜組織断片をペトリ皿にデカントし、麻酔下の卵化動物におけるつま先ピンチに対する応答性の欠如を確認する。マウスを腹側の位置に消毒し、腹部に1.5センチメートルの縦切開を行います。筋肉から皮膚を分離し、腹腔にアクセスするために筋肉の2番目の1.5センチメートルの切開を行います。
腹筋壁の左端をミニ鉗子で保持し、筋肉を折り畳んで動物の外側の腹膜の内面を露出させる。ミニピンセットを使用して、1つの子宮内膜インプラントをn-ブチルエステルシアノアクリル酸接着剤に短時間浸し、その断片を腹膜に取り付けます。接着剤を乾燥させたら、ちょうど実証したように腹膜の反対側に第2のインプラントを置く。
吸収性6-0縫合糸を使用して筋肉層を閉じ、非吸収性6-0縫合糸を使用して皮膚を閉じます。その後、防腐液で皮膚切開をきれいにし、完全な再発まで監視して回復ゾーンに動物を置きます。移植された組織断片の生体内蛍光イメージングの場合、移植手術後24~48時間後に生体内イメージングシステムをオンにし、ソフトウェアを初期化し、CCDカメラを数分間冷却します。
装置が準備ができたら、最初の麻酔マウスをインビボイメージングシステムケージに入れ、supineの位置に、麻酔機械に接続された管状の中に頭部を置き、蓋を閉じます。次に、[取得] をクリックして、結果として得られる 5 つの画像を保存します。インビボ蛍光を定量化するには、適切な画像解析ソフトウェアで[参照]をクリックし、分析対象の混合されていないファイルを選択します。
新しいウィンドウが表示されます。[追加] をクリックして、異なるタイム ポイントで各動物の混合されていないファイルをすべて含め、グループとして [ロード] をクリックします。すべての画像は、1 つのシーケンスで表示されます。
ツール パレット ウィンドウで、個々のスケール チェックボックスをオフにしてすべてのイメージを同じ尺度に調整し、シーケンスの 1 つのイメージをダブルクリックします。対象領域を作成するには、対象領域ツールで輪郭と自動1つのオプションを選択し、円の形状をクリックして、蛍光信号の中心に円を配置します。[作成] をクリックして対象領域を作成し、信号がない背景に対象領域をコピーして貼り付けます。
次に、対象の領域を測定し、すべての領域を選択して各領域の蛍光強度の値を表示し、これらの値をスプレッドシートにコピーして貼り付けます。子宮内膜フラグメントの標識は、非感染した子宮内膜組織自家蛍光よりも有意に堅牢である近赤外セクションで蛍光を発するタンパク質であるmCherryを発現するように設計されたアデノウイルスによる感染によって達成される。モニタリング中、mCherryの基準波長に加えて、蛍光画像は励起発光波長フィルタの異なるペアで撮影されます。
バックグラウンドからの病変の特徴的な蛍光組織発光プロファイル、および宿主組織によって発される自己蛍光を定義するために、各時間の間に動物が発する生蛍光を含むモニタリング画像を、単一のファイルにまとめ、非正規化する。次に、蛍光は、混合されず、正規化され、偽色画像として表され、特定の軍団および背景信号に対応する関心領域がプログラムによって自動的に認識され、定量化される。関心信号の背景領域は、対象の信号のリージョン領域から差し引かれます。
そして、各時点における強度の結果は、強度が最大となる時点に対して正規化されます。数週間のモニタリングの後、実行可能なインプラントをさらに下流の分析のために回収することができる。この手順を試みている間、組織の生存率を損なうことなく、最も輝かしい信号を提供するAd-mCherryの濃度を選択することを忘れないでください。
この手順に従って、病変を回収し、追加の特徴的なパラメータを研究するために使用することができます。この手順は、異種移植片ヒト子宮内膜症病変の非侵襲的モニタリングに最適化される。しかし、それは、リアルタイムで異種移植片の部位に対する関心のある特定の薬物の影響を評価するために容易に適応することができる。
