Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na avaliação dos efeitos de drogas terapêuticas no campo da endometriose, como os efeitos de compostos anti-androgênicos no tamanho das lesões endometriotes. A principal vantagem dessa técnica é que os efeitos das drogas específicas podem ser avaliados em modelos animais de endometriose em tempo real, e não no ponto final. O procedimento será Jessica Martinez, que é técnica do meu laboratório, assim como Viviana Bisbal e Nerea Marin, que são veterinárias do Centro de Investigação Principe Felipe e que são colaboradores próximas com nossa equipe.
Dois a três dias antes da cirurgia de implante, transfira fragmentos de biópsia de tecido endometrial saudável e lavados em uma placa de Petri de 10 centímetros contendo meio completo, e use bisturis para picar o tecido em pedaços de cinco a dez milímetros. Usando uma micropipette, adicione 30 a 50 gotas de microliter de DMEM na parte inferior de um novo prato de cultura de 10 centímetros, deixando espaço suficiente entre cada gota para que eles não entrem em contato uns com os outros. Quando todas as gotas tiverem sido colocadas, use uma agulha de seringa para colocar um único pedaço de tecido de biópsia em cada gota.
Em seguida, adicione 100 a 200 microliters de adeno-mCherry recém-preparado a um poço de uma placa de 96 poços por fragmento de tecido, além de três poços com DMEM livre de adenovírus como um controle negativo. Em seguida, use a agulha para transferir uma amostra de tecido em cada poço de solução adeno-mCherry para uma incubação durante a noite a 37 graus celsius e 5%DE CO2. Na manhã seguinte coloque a placa em um estágio de microscópio de fluorescência e use um laser de 568 nanômetros para verificar os fragmentos para uma rotulagem ideal.
Usar a diluição apropriada de infectar mCherry adenovírus é fundamental para uma rotulagem eficiente do tecido. Assim, para determinar a concentração adequada, vários para diluição mCherry, para cada experimento individual, devem ser avaliados. Em seguida, transfira os fragmentos mais brilhantes para poços individuais de uma nova placa de 96 poços contendo meio fresco e completo.
Pelo menos sete dias após a oofrectomia, decante os fragmentos de tecido endometrial em uma placa de Petri, e confirme a falta de resposta para beliscar o dedo do dedo em um animal anestesiado e oofrectomizado. Com o rato na posição supina desinfetar a área ventral e fazer uma incisão longitudinal de 1,5 centímetros no abdômen. Separe a pele do músculo e faça uma segunda incisão de 1,5 centímetros no músculo para acessar a cavidade peritoneal.
Segurando a borda esquerda da parede muscular abdominal com mini-fórceps, dobre o músculo para expor a face interna do peritônio na parte externa do animal. Use mini pinças para absorver brevemente um implante endometrial no adesivo de cianoacrilato de n-butil e anexar o fragmento ao peritônio. Quando o adesivo estiver seco, coloque um segundo implante no lado contralateral do peritônio como apenas demonstrado.
Use uma sutura 6-0 absorvível para fechar a camada muscular e uma sutura 6-0 não absorvível para fechar a pele. Em seguida, limpe a incisão da pele com solução antisséptica e coloque o animal na zona de recuperação com monitoramento até a recumbência total. Para imagens fluorescentes in vivo dos fragmentos de tecido implantado, 24 a 48 horas após a cirurgia de implantação ligar o sistema de imagem in vivo, inicializar o software e permitir que a câmera CCD esfrie por alguns minutos.
Uma vez que o instrumento esteja pronto, coloque o primeiro rato anestesiado na gaiola do sistema de imagem in vivo, na posição supina, com a cabeça dentro de um túbulo conectado à máquina de anestesia, e feche a tampa. Em seguida, clique em adquirir e salvar as cinco imagens resultantes. Para quantificar a fluorescência in vivo, no software de análise de imagem apropriado clique em procurar e selecione o arquivo de interesse não misturado a ser analisado.
Uma nova janela aparecerá. Clique em adicionar à lista para incluir todos os arquivos não misturados de cada animal em diferentes pontos de tempo e clique em carregar como um grupo. Todas as imagens devem aparecer em uma única sequência.
Na janela da paleta de ferramentas, desmarque a caixa de seleção de escala individual para ajustar todas as imagens à mesma escala e clique duas vezes em uma imagem da sequência. Para criar uma região de interesse, na região de ferramentas de interesse selecione as opções contorno e auto um, e clique na forma de círculo para colocar o círculo no centro do sinal fluorescente. Clique em criar para criar a região de interesse e copiar e colar a região de interesse em um fundo onde não há sinal.
Em seguida, clique em medir regiões de interesse e selecione todas para exibir valores para a intensidade de fluorescência de cada região e copie e cole esses valores em uma planilha. A rotulagem dos fragmentos endometrial é obtida pela infecção com adenovírus projetado para expressar mCherry, uma proteína que emite fluorescência na seção quase infravermelha que é significativamente mais robusta do que a autofluorescência do tecido endometrial não infectado. Durante o monitoramento, além do comprimento de onda de referência para mCherry, imagens fluorescentes são tiradas com diferentes pares de filtros de comprimento de onda de emissão de excitação.
Para definir os perfis característicos de emissão de tecido fluorescente das lesões a partir do fundo, e a autofluorescência emitida pelos tecidos hospedeiros, as imagens de monitoramento contendo fluorescência bruta emitida pelos animais durante cada ponto de tempo são reunidas, nãonormalizadas, em um único arquivo. Em seguida, a fluorescência é não misturada, normalizada e representada como uma falsa imagem colorida, e as regiões de interesses correspondentes a legiões específicas e sinais de fundo são automaticamente reconhecidas pelo programa e quantificadas. A região de fundo de sinalização de interesse é subtraída da região legião de sinais de interesse.
E os resultados da intensidade em cada ponto de tempo são normalizados em relação ao ponto de tempo em que a intensidade é máxima. Após várias semanas de monitoramento, os implantes viáveis podem ser recuperados para análises mais a jusante. Ao tentar este procedimento é importante lembrar de selecionar a concentração de Ad-mCherry que fornece o sinal mais brilhante sem comprometer a viabilidade do tecido.
Após este procedimento, as lesões podem ser recuperadas e utilizadas para estudar parâmetros distintos adicionais. Este procedimento é otimizado para o monitoramento não invasivo de lesões de endometriose humana de xenoenxerto. No entanto, pode ser facilmente adaptado para avaliar os efeitos de uma droga específica de interesse nos sites de um xenoenxerto em tempo real.
