HUVEC трубообразования Анализ для оценки воздействия натуральных продуктов на ангиогенез

Анализ трубообразования является тестом in vitro для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе нескольких шагов, которые приводят к образованию новых кровеносных сосудов. Этот анализ позволяет определить соединения и сигнальные каскады, связанные с ангиогенезом. С помощью одного теста мы можем показать, что такое природное соединение, как RGWE, снижает способность эндотелиальных клеток формировать трубчатую структуру, не влияет на жизнеспособность клеток, и что этот эффект зависит от активации пути MEK/ERK. Важно выполнить тест с правильным количеством клеток. В самом деле, слишком мало или слишком много клеток не может позволить правильное образование труб. По этой причине рекомендуется провести предварительный тест, чтобы выяснить правильное количество клеток. Лука Ольга Пасторино, аспирантка моей лаборатории, покажет процедуры. Во-первых, собирать Ruta graveolens листья в течение весенних и летних месяцев. Положите 250 граммов измельченных листьев в коническую колбу и добавьте один литр дистиллированной воды, кипятите и фильтруйте, как описано в рукописи. На следующий день используйте лиофилизатор, чтобы лиофилизировать экстракт листьев. После получения порошка, взвесить его, и разделить его на aliquots. Культура HUVECs в эндотелиальной среде роста клеток, в соответствии с текстовым протоколом. Когда клетки достигают 80%-ного слияния, проходят клетки в соотношении одного к трем. Используйте ячейки, полученные между проходом два и проход пять. После прохождения HUVECs достичь 70%confluency, трансвектировать их с одним микрограммом вектора, содержащего ген interest.Combine один микрограмм ДНК с тремя микролитров разбавленного липофектамина 2000.Then, удалить среду из HUVECs, и заменить его на один миллилитр свежей полной среде. Добавьте раствор поперечного в клетки и инкубировать клетки при 37 градусах цельсия и пятипроцентный углекислый газ. Через три часа после трансвекции добавьте семь миллилитров свежей полной среды и инкубировать клетки еще на 24-48 часов. Непосредственно перед приготовлением подвала, положить предварительно охлажденный, 96-хорошо пластины на льду, и добавить 50-микролитров холодной матрицы к каждому хорошо. В то время как пластина инкубирует, мыть HUVECs с одним миллилитром раствора PBS/EDTA. Затем добавьте в клетки один миллилитр раствора трипсина-ЭДТА и инкубировать в течение пяти минут при 37 градусах по Цельсию.Соберите среду, содержащую подвесные клетки, и соберите клетки с помощью центрифугации. Затем, повторного перерасхода клеток в один миллилитр PBS. Передача 0,2-миллилитров клеточной подвески на 0,5 миллилитров PBS с трипаном синего раствора. После проведения подвески при комнатной температуре в течение пяти минут, подсчитайте клетки в B