Этот метод должен быть интересом для исследователей, которые пытаются изолировать рнк белковых комплексов и определить их состав по масс-спектрометрии. Мы считаем, что наш протокол будет особенно полезен для очистки комплексов, которые существуют в клетках в ограниченных количествах и, как правило, разобщаются во время длительных многоступенчатых процедур очистки. Основным преимуществом этого метода является то, что он включает в себя только один шаг очистки и может быть использован с РНК связывающих сайтов любой длины и последовательности.
Демонстрация некоторых шагов будет Сяо-куй Ян, который является старшим научным специалистом в нашей группе. Для связывающих участков, значительно более 65 нуклеотидов, получите РНК, генерируемую T7, и адаптер oligonucleotide PCB, как указано в текстовом протоколе. Смешайте 20 пикомолов РНК со 100 пикомолами олигонуклеотида адаптера в 1,5 миллилитровой трубке, содержащей 100 микролитров связывающего буфера.
Поместите трубку в кипящую воду и дайте ей инкубировать в течение 5 минут. Затем дайте воде остыть до комнатной температуры. Первая добавка 1 миллилитр ядерного экстракта мыши с 80 миллимолярной ЭДТА при рН 8 до конечной концентрации 10 миллимолей.
Затем добавьте от 5 до 10 пикомолов РНК-субстрата, который был помечен с PCB moiety. Инкубировать на льду в течение 5 минут, убедившись, что иногда смешивать образец. Затем используйте предварительно охлажденный микроцентрифуг при 4 градусах Цельсия, чтобы центрифугировать смесь при 10 000 раз г в течение 10 минут, чтобы удалить любые потенциальные осадки.
Тщательно соберите супернатант в новую трубку на льду, при этом будьте осторожны, чтобы избежать передачи гранул. Перенесите около 100 микролитров подвески streptavidin agarose bead в 1,5 миллилитровую трубку. Добавьте приблизительно 1 миллилитр связывающего буфера, чтобы начать мыть бисер.
Центрифуга трубки в 25 раз г в течение 2 до 3 минут и аспирировать супернатант. Повторите этот процесс стирки и центрифугации 2-3 раза, чтобы уравночные бусы с связывающим буфером. Загрузите ранее собранный супернатант, который содержит собранный комплекс над уравновешенными бусинами.
Используя трубчатый ротатор, поверните трубку в течение 1 часа при 4 градусах по Цельсию, чтобы обездвижить РНК и связанные комплексы на бисер. Далее спина трубки в 25 раз г в течение 2 до 3 минут, чтобы собрать бисер в нижней части трубки. Аспирировать супернатанта.
И промыть бисер дважды с обязательным буфером, используя ранее описанный процесс стирки. После удаления супернатанта второй стирки добавьте 1 миллилитр связывающего буфера и поверните образец на 1 час при 4 градусах по Цельсию. Спин вниз образца в 25 раз г в течение 2 до 3 минут.
Затем добавьте 1 миллилитр связывающего буфера и перенесите подвеску в новую трубку. Поверните образец при 4 градусах по Цельсию на срок до 1 часа. Центрифугировать обездвиженые комплексы 25 раз г в течение 2-3 минут.
Затем аспирировать супернатант, и добавить 200 микролитров связывающего буфера. Перенесите бисер в 500 микролитровую трубку. Включите ультрафиолетовую лампу высокой интенсивности, которая излучает УФ-излучение на 365 нанометров и позволяет ему достичь полного блеска.
Заполните дно чашки Петри плотно упакованным льдом, укладыв ее на крышку тарелки. Кратко вихрь трубки, содержащей обездвиженые комплексы. Затем поместите его горизонтально на лед и накройте его предварительно разогретой лампой, убедившись, что образец составляет от 2 до 3 сантиметров от поверхности лампы.
Облучать образец в общей сложности 30 минут, часто инвертирование и вихревые трубки для обеспечения равномерного воздействия и предотвращения перегрева. После этого, спина вниз бусы на 25 раз г в течение 2 до 3 минут и собирать супернатант. Центрифуга этого супернатанта еще раз с использованием тех же условий.
Соберите полученный супернатант убедившись, что оставить небольшое количество в нижней части трубки, чтобы избежать передачи каких-либо остаточных шариков. Используя электрофорез SDS-PAGE, отделяйте долю УФ-элетатного супернатанта и соответствующую фракцию от материала, останого на бисере после УФ-элюции. Далее используйте коммерчески доступные серебряные окрашивания комплект для окрашивания геля.
Оцените эффективность УФ-элюции, сравнив интенсивности белков, присутствующих в УЛЬТРА элатенанте, и тех, которые остались на бисере после уф-облучения. Акциз белковых полос, представляющих интерес и определить их идентичность по масс-спектрометрии. После этого напрямую проанализируйте фракцию уф-надутого супернатанта с помощью масс-спектрометрии, чтобы объективно определить весь протеом очищенного материала.
В этом исследовании, рнк стволовой петли помечены фото-расщепляемый биотин инкубируется с 1 миллилитр цитоплазмической S100 экстракт, полученный из клеток миеломы мышей. А эффект и эффективность УФ-элюции анализируется с помощью окрашивания серебра. Ряд белков обнаруживается на стрептавидиновых бусинках перед УФ-элюционом.
Облучение длинной волной УФ высвобождает только некоторые из этих белков в супернатант, оставляя неспецифический фон на бисере. Это подчеркивает важность шага УФ-элюции. Масс-спектрометрия определяет основные ультрафиолетовые элевные белки как 3'hExo и SLBP с SLBP представлены как белка полной длины и ряд более коротких продуктов деградации.
Меньшее количество других белков, идентифицированных как различные рнк связывающие белки, также выборочно высвобождается в раствор путем УФ-облучения. УФ-элевации обездвиженных Drosophila histone предварительно мРНК помечены фото-расщепляемый биотин инкубируется с ядерным экстрактом привело к селективного выпуска лишь небольшое количество белков в супернатант с интенсивным фоном неспецифических белков, оставшихся на бисере. Масс-спектрометрия определяет эти белки как компоненты SnRNP U7.
Они не обнаруживаются в присутствии конкурентов по обработке, которые блокируют привязку U7 snRNP к histone pre-mRNA. Важно использовать ультрафиолетовую лампу высокой интенсивности и поместить ее на близкое расстояние до облученной образца, а также убедиться, что она не перегревается. Метод УФ-элуции дает местные белковые комплексы РНК, которые не имеют основных загрязняющих веществ и непосредственно подходят для дополнительных шагов очистки и функциональных анализов.
Избегайте воздействия на глаз и кожу во время уф-облучения.
