Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области флуоресцентных белков, таких как, как флуоресцентные белки могут повлиять на их партнеров по синтезу. Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает быструю и легко масштабируемую оценку воздействия флуоресцентных белков и их партнеров по синтезу. Хотя этот метод может дать представление о поведении флуоресцентного белка, он также может быть применен к другим генетически закодированным тегам.
Также эту процедуру демонстрировала Соня Ди Грегорио, которая является аспиранткой Западного университета. Каждый флуоресцентный белок, который тестируется с помощью этого метода сначала клонируется в вектор выражения дрожжей, который кодирует галактозную непритязательную версию FLAG-тегами HTT exon один укрывательство либо нетоксичные 25 "повторить или Хантингтон болезни, связанные токсичные 72" повторить. Клоны отбираются и проверяются с помощью последовательности и впоследствии преобразуются в дрожжи.
Чтобы подготовить клеточные культуры для различных анализов, полоса дрожжей клонов проведения 25 "или 72" тег с флуоресценции белка интереса на агар пластины, содержащей дрожжи отбора среды с глюкозой в качестве источника углерода. В то же время, полоса дрожжей проведения 25 "или 72" дрожжи оптимизированы мономерные суперфолдер GFP, чтобы служить в качестве положительного контроля. Инкубировать пластины при 30 градусах по Цельсию в течение двух-трех дней.
Выберите до трех одиночных колоний из каждой пластины и привить пять миллилитров синтетической полной среды, дополненной 2%глюкозой в качестве источника углерода. Инкубировать культуры при 30 градусах по Цельсию в одночасье. На следующий день перенесите 200 микролитров каждой ночной культуры в микроцентрифугную трубку и центрифугу для гранул.
Вымойте по крайней мере три раза стерильной дистиллированной водой. Важно, чтобы мыть клетки хорошо, чтобы устранить все следы глюкозы, которые могут способствовать подавлению индукции промоутера GAL1. Подготовьте клетки, как поопродемонстрировано ранее, и повторно приостановите их в синтетической полной среде, содержащей 2%galactose в качестве источника углерода, чтобы вызвать экспрессию синтезов полиэ.
В качестве контроля повторно приостанавливают клетки в глюкозсодержащих средствах массовой информации. Инкубировать клетки при 30 градусах по Цельсию в трубчатом ротаторе на ночь. На следующее утро измерьте оптическую плотность на 600 нанометров каждой культуры с помощью спектрофотометра.
Уравняйте плотность клеток до оптической плотности 600 из 2 в 100 микролитров синтетической полной среды в стерильной пластине 96-колодец. Подготовь четыре пятикратных разбавления каждого образца путем пипетки 20 микролитров образца из предыдущего а также в 80 микролитров средств массовой информации в следующей хорошо. Используйте дрожжевой инструмент для закрепления, чтобы обнаружить клетки на селективных пластин и инкубировать при 30 градусах по Цельсию в течение двух дней.
Изображение пластин с устройством документации изображения. Подготовьте клеточные культуры для этого анализа, а затем измерить OD600 каждой культуры с помощью спектрофотометра. Разбавить клетки до OD600 из 1 в 300 микролитров средств массовой информации в 96-хорошо пластины.
Подготовь каждый образец в трипликат. Инкубировать пластину в инкубаторе для чтения пластин с возможностями встряхивания. Установите количество образцов, температуру на уровне 30 градусов по Цельсию, абсорбт на 600 нанометров, продолжительность экспериментов до 24 часов и интервалы измерений до 15 минут.
Выберите режим непрерывного встряхивания. Когда эксперимент будет проведен, создайте кривую роста и количественно области под кривой с помощью научного программного обеспечения графики. Вставьте данные в таблицу XY с тремя значениями репликации.
Кривая роста будет показана под папкой графиков с левой стороны. Для количественной оценки области под кривой, выберите анализ в левом верхнем и нажмите области под кривой в XY анализов. Начните эту процедуру с разбавления подготовленных клеток в 10 раз в среде роста.
Перенесите 200 микролитров каждого образца в камеру визуализации из восьми колодец. Изображение клеток с помощью стандартного широко полевого флуоресцентного микроскопа. Отрегулируйте настройки изображения для получения изображений.
Так как агрегаты 72 "гораздо ярче, чем рассеянный сигнал 25 ", часто требуется использовать различные настройки приобретения между различными плазмидами, чтобы избежать насыщения флуоресцентного сигнала. Обработка изображений с помощью подходящего программного обеспечения для обработки изображений. В этом протоколе, точка пятно используется для изучения уровня экспрессии белка.
Подготовь буфер для генерации белковых лизатов, добавив четыре микромолара фенилметилсульфонилового фтора и коктейль ингибитора протеазы в буфер лиза. Пеллет пять миллилитров каждой ночной культуры по центрифугации. Повторно приостанавливайте клетки в 200 микролитров стеклянных бусин и 200 микролитров буфера лиза.
Вихрь в течение 30 секунд в течение 12 раундов, обледенения между раундами. Центрифуга при 12 000 раз G при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут и собирать супернатант. Используйте микрофильтрационный аппарат, чтобы обнаружить равное количество общего белка на мембране нитроцеллюлозы.
Предварительно промокнуть мембрану с PBS и собрать аппарат. Подключите его к вакууму источника и убедитесь, что винты затянуты. Загрузите образцы, включите вакуум и дайте образцу фильтроваться через мембрану под действием силы тяжести.
Пятно мембраны в PBS 05%Tween 5%обезжиренное молоко в течение 30 минут. Инкубировать мембрану с первичными антителами против флага на четыре градуса по Цельсию в одночасье. На следующий день, мыть мембрану три раза в течение 10 минут каждый с PBS 05%Tween.
Инкубировать мембрану с флуоресцентно помечены вторичные антитела в PBS 05%Tween 5%жира свободного молока при комнатной температуре в течение одного часа. Вымойте мембрану три раза в течение 10 минут каждый с PBS 05%Tween. Впоследствии, изображение мембраны с помощью системы документации помарке аминокислот.
Дрожжи, выражают либо 25 "или 72" HTT exon один сливается с дрожжами оптимизированы мономерные суперфолдер GFP или дрожжи оптимизирован мономерный тег BFP2 был выучен в глюкозе или галактозы среды на ночь и либо заметили на агар пластин или инкубируется дальше в жидких носителях. В то время как дрожжи 72 "оптимизирован мономерный суперфолдер GFP вызывает значительный дефект роста. 72 "дрожжи оптимизированы мономерные теги BFP2 отображает фенотип роста похож на нетоксичные 25" аналоги о том, что природа флуоресцентных тегов может препятствовать поведению расширения полио в клетках.
Оценка агрегации флуоресцентных синтезов поликью с помощью флуоресцентной микроскопии показывает, что 72 "дрожжи оптимизированы мономерный суперфолдер GFP отображает значительную агрегацию, в то время как 72" дрожжи оптимизированы мономерный тег BFP2 отображает рассеянный цитоплазмический сигнал похож на нетоксичные 25 "аналогов. Так как уровни экспрессии различных слияний полио могут повлиять на токсичность, точечные помарки были выполнены для оценки уровня белка. Показаны результаты пятикратного разбавления ликатов клеток.
Не забывайте, что этот метод позволяет быстро сравнивать нехарактеризованные и флуоресцентные белки с вариантами GFP, но он не может напрямую оценить олигомеризацию. После этой процедуры, другие меры, например, анализ язвы в клетках млекопитающих могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как мономерное состояние флуоресцентных белков.
