В этом видео мы описываем простой и эффективный метод визуализации и анализа репертуара антител на глобальном уровне. Можно описать весь репертуар В-клеток у людей и их динамические изменения в ответ на иммунную стимуляцию. Этот метод может быть применен для анализа патологических образцов у пациентов возникающих вирусных инфекций и для получения данных с беспрецедентным пониманием патогенеза инфекции.
Одной из наиболее интересных областей для применения является контроль вакцины. Эффективность вакцины можно оценить путем анализа динамики глобального репертуара антител у лиц, управляемых вакцинами. Индивидуум нов к этому методу может оптимизировать условия PCR потому что эффективность усиления гена антитела зависит на типах стартовых материалов.
Фла-шер для идентификации иммуноглобулинов. Важно продемонстрировать эти действия визуально. Демонстрация процедуры будет мисс Саюри Ямагути и г-н Ханбин Сюэ, техник и аспирант из моей лаборатории.
Чтобы начать эту процедуру, вскрыть ткань из восьминедельной C57 черный шесть мыши и передать его через сетку из нержавеющей стали с двумя миллилитров PBS для получения рассеянных клеток. Перенесите подвеску клетки в двухми миллилитровую микроцентрифугную трубку и центрифугу при 600 г и при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Отбросьте супернатант и добавьте 800 микролитров буфера лизайного ACK к грануле.
Инкубировать на льду в течение двух минут, чтобы подысать красные кровяные тельца в ткани. Далее, мыть клетки тканей три раза с помощью трех миллилитров PBS для каждой стирки. Центрифуга снова в 600 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут.
Откажитесь от супернатанта и добавьте 800 микролитров фенола/гуанидина изотиоцианата реагента в гранулы и вихрь тщательно. Инкубировать при 25 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Затем добавьте 200 микролитров хлороформа и встряхните вручную в течение 15 секунд.
Инкубировать при 25 градусах по Цельсию в течение двух минут. Центрифуга при 12 000 раз г и при 25 градусах по Цельсию, чтобы отделить фазы. Перенесите верхнюю aqueous фазу к свежей пробке.
Добавьте один том 70% этанола. Vortex кратко и применить эту смесь к колонке кремнезема спина. Утете РНК с 30 до 100 микролитров воды.
После этого используйте флюорометр для количественной оценки начальной концентрации РНК. Храните очищенную РНК при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Во-первых, синтезировать первую прядь cDNA от двух до 10 микрограммов общего шаблона РНК с помощью 5'RACE CDS грунтовки и олигонуклеотида SMART-PCR в соответствии с инструкциями производителя.
Для мыши иммуноглобулин, ПЦР усиливают cDNA с высокой точностью ДНК полимеразы, используя универсальный вперед грунтовки и иммуноглобулин класса конкретных обратных грунтовки, как указано в текстовом протоколе. Для иммуноглобулина человека, выполнить первый ПЦР с использованием универсального вперед грунтовки и иммуноглобулин класса конкретных обратных грунтовки с тегами последовательностей. Включите последовательности индексов для каждого образца по второму ПЦР с использованием праймеров последовательность индексов.
Далее, электрофорез любой из продуктов ПЦР на 2%agarose гель. Визуализуй ДНК-полосы на уф-трансиллюминаторе и вырежьте ломтик геля, содержащий широкую полосу между 600 и 800 базовыми парами. Добавьте 10 микролитров мембранно-связывающего раствора на 10 миллиграммов ломтика геля.
Смешайте и инкубировать при 50 до 65 градусов по Цельсию, пока гель ломтики полностью растворяются. Затем перенесите раствор геля на колонку вращения кремнеземной мембраны. Вымойте столбец один раз с помощью буфера для мытья и утехи ДНК с помощью 50 микролитров воды без нуклеазы.
Используя флюорометр, количественно очищаемые ампликоны и объединить ампликоны из каждого класса иммуноглобулина в равных количествах для секвенирования NGS. После этого используйте микрокапильярий на основе электрофореза с чипом размеров ДНК для определения размера и концентрации библиотек. Храните библиотеки при температуре минус 20 градусов по Цельсию.
Во-первых, создать образец таблицы секвенирования запуска, как указано в текстовом протоколе. Далее оттаивать реагент картриджа и библиотек. Сделайте 0,2 нормального раствора гидроксида натрия и разбавьте библиотеки, чтобы получить желаемые концентрации моляров.
Затем прополощите и высушите ячейку потока и добавьте 600 микролитров разбавленного и денатурированного библиотечного раствора в колодец картриджа реагента и начните секвенирование. Перспектива murine антител репертуара в целом могут быть получены из клеток или тканей, таких как селезенка, костный мозг, лимфатический узел, или крови. Здесь показаны репрезентативные результаты репертуаров световой цепи IgM, IgG1, IgG2c и иммуноглобулина из наивной селезенки мыши.
В V(D)J перестановки 3D V(D)J участок, размер каждого шара представляет собой относительное количество читает. Другими словами, он представляет собой количество мРНК антител в целых клетках группы В. 3D-сетка состоит из 110 иммуноглобулиных тяжелых генов цепи V, 12 генов иммуноглобулина тяжелой цепи D и четырех иммуноглобулиных тяжелых цепных J генов, которые выровнены, чтобы отразить их порядок на хромосоме.
Сюжет 2D VJ показывает профиль перестановки VJ в репертуаре IGL. Длина каждого бара представляет собой относительное количество считых. X-ось представляет 101 иммуноглобулин световой цепи V-каппа генов, и три иммуноглобулина световой цепи V-lambda генов, и Y-оси представляет собой четыре иммуноглобулина световой цепи J-каппа генов, и три иммуноглобулина световой цепи J-lambda генов.
Перспектива репертуара антител человека в целом может быть проанализирована из различных тканей, включая периферические моноядерные клетки крови или патологические ткани. Здесь показаны репрезентативные результаты IgM, Total IgG, Total IgA, IgD, IgE и IgL из нормальных периферических моноядерных клеток крови. Как и модель murine, репертуарный профиль перестановки V(D)J отображается на сюжете 3D V(D)J, в котором размер каждого шара представляет собой относительное количество считываний.
3D-сетка состоит из 56 генов иммуноглобулина тяжелой цепи V, 27 генов иммуноглобулина тяжелой цепи D и шести генов иммуноглобулина тяжелой цепи J, выровненных в порядке, в каком они появляются на хромосоме. Профиль перестановки VJ в репертуаре IgL изображен в сюжете 2D VJ, в котором длина каждого бара представляет относительное количество считываний. X-ось представляет собой 41 иммуноглобулиновую световую цепь V-каппа генов, и 32 иммуноглобулин световой цепи V-lambda генов, и Y-оси представляет собой пять иммуноглобулин световой цепи J-каппа генов, и пять иммуноглобулин световой цепи J-lambda генов.
В материале исследования этого протокола можно ехать небольшое количество отсортированных клеток по цитометрии потока или даже клочья патологических образцов. Однако потребуется тщательная оптимизация условий ПЦР. Поскольку выходная информация этого протокола огромна, грамотность в области биоинформатики поможет найти структуру сети антител.
Это приведет к глубокому пониманию иммунной системы.
