Мембранные и клеточные стенки селективных флуоресцентных красителей являются важными инструментами для анализа динамики органелл и живых грибковых клеток. Наши протоколы обеспечивают необходимую теоретическую основу и практические руководящие принципы для применения выбора этих красителей, как действительно жизненно важные пятна. Ключевым моментом для этого является использование очень низких концентраций красителей, которые не вызывают клеточных артефактов, связанных с насыщением или токсичностью красителя, обеспечивая при этом хороший сигнал к шумовым соотношениям для высококачественной, долгосрочной визуализации живых клеток.
С коллегами из кафедры ядерной медицины медицинского университета, мы недавно использовали эти методы окрашивания для разработки нового подхода для изображения управляемой диагностики aapergillosis. Способность контролировать мембранные и клеточные стено стенки структур в режиме реального времени имеет решающее значение для определения динамики поглощения экспериментального соединения наркотиков. Чтобы начать эту процедуру, сначала получите подготовленную прекультуру.
Используйте стерильный скальпель, чтобы вырезать небольшой агар блок, который несет неспоруляции мицелия из колонии края прекультуры. Поместите агар-блок в центр свежей, твердой средней пластины для прививки экспериментальной культуры. Инкубировать экспериментальную культуру в соответствии со стадией развития, предназначенной для инкубации.
Подготовка образцов несколько деликатна, а оптимизация настроек приобретения изображений довольно сложна. Визуальная демонстрация обеих процедур, сопровождаемая устным объяснением, значительно облегчает реплицируемость. Чтобы смонтировать образцы, держите чистый 24 на 60 миллиметров стеклянный покров скольжения готовы и добавить 18 микролитров жидкости минимальный средний или физиологический раствор соли на центр.
Добавьте два микролитров подготовленного 20 микромолярского красителя рабочего раствора в жидкость в центре крышки скольжения и хорошо перемешать, трубя вверх и вниз несколько раз, избегая при этом производства пузырьков воздуха. Используя чистый скальпель, вырежьте образец размером 15 на 15 миллиметров с периферии колонии и поместите его вертикально рядом со средним падением на крышку скольжения. Используйте скальпель для поддержки верхнего края блока и пальцем, чтобы держать заднюю сторону блока на месте.
Затем медленно опустите бок, неся мицелий на жидкость. Навемите подготовленный образец на сцену микроскопа. Во-первых, отрегулируйте основные настройки приобретения изображений, чтобы зафиксировать динамику положения в отдельных hyphae, как указано в текстовом протоколе.
Для анализа поглощения эндоцитоза проконсультируйтесь с первой цифрой и таблицей одного из текстовых протоколов, чтобы определить наилучшие настройки возбуждения и выбросов для FM 143 или FM 464, которые доступны в системе микроскопии и соответствующим образом настроить эти настройки в системе. Начните запись изображения с помощью ранее скорректированных настроек и оцените результаты. Затем оптимизируйте настройки получения изображения до пространственного и временного разрешения, необходимого для захвата аспекта плазменной мембраны или динамики эндоцитоза, на который ориентирован эксперимент.
Для динамики клеточной стенки проконсультируйтесь с рисунком четыре и таблицей одного из текстового протокола, чтобы определить наилучшие настройки возбуждения и выбросов для прикладного красителя клеточной стенки и соответствующим образом настроить настройки на системе микроскопии. Начните запись изображения с помощью ранее скорректированных настроек и оцените результаты. Затем оптимизируйте настройки захвата изображения до пространственного и временного разрешения, необходимого для захвата аспекта морфогенеза клеточной стенки, на который ориентирован эксперимент.
Помимо визуализации клеточных процессов, живая клеточная визуализация позволяет получать количественную информацию из записанных данных. В примере анализа поглощения FM 464 грибковые образцы культивируются как колонии и устанавливаются методом перевернутого агара блока. Анализы выявили дефекты в пространственно-временной организации эндоцитоза при удалении генов и чрезмерной экспрессии генов мутантов грибкового специфического белка SFP 2 триходермы андровирида.
Здесь показаны примеры совместного окрашивания FM 464 флуоресцентных белков синтеза, нацеленных на эндоцитные отсеки. Это совместное окрашивание используется для связи субклеточного распределения двух расширенных зеленых флуоресцентных белков помечены трансмембранных белков, SFP 2 и GPR 1, к эндоцитическому пути в триходермы атровирид. Пример совместного окрашивания FM 464 для выявления морфогенетических различий показывает, что это совместное окрашивание позволяет дальнейшее отношение субклеточной динамики локализации flourescently помечены BUD-6 полярности комплексный белок до конца некоторых процессов, зависящих от торговли людьми, таких как образование септы и поляризованной гипхал-наконечник роста.
Он также характеризует различия в субклеточной организации и гипхал-архитектуры между диким типом и мутант штаммов neurospora crassa. Представитель окрашивания клеточных стенок показывает, что различные свойства взаимодействия кальцифтор белый, solophenyl флавин, и конго красный с полимерами клеточной стенки выделить морфогенетические различия между дельта SFP 2 мутант и дикий тип штамма триходермы андровирид. Увеличение клеточной стенки стресс, нанесенный повышенной концентрации красителя происходит быстрее и более выраженным в мутант по сравнению с диким типом.
Кроме того, те же изображения позволяют количественно определить морфогенетические различия в отношении диаметра гипхала и расстояния перегородки между обоими штаммами. Представитель в режиме реального времени мониторинга биосинтеза клеточной стенки показывает, что очень низкая концентрация кальцифлюора белой предотвращает насыщение клеточной стенки молекулами красителя и позволяет количественно в режиме реального времени контролировать биосинтез клеточной стенки. Это показывает, что осаждение нового материала стены клетки не является однородным, но очень быстро реагирует на локализованные физические нагрузки в результате относительного перемещения одной клетки на клетку к клетке привязанности до дермалинфузии в neurospora crassa.
Чем меньше, тем больше. Используйте как можно меньше красителя, чтобы исключить вмешательство флуоресцентного маркера в клеточные процессы. После этой процедуры, восстановление flourescence после фото-отбеливания эксперименты могут быть выполнены для количественной оценки транспорта и биогенеза кинетики.
Первое введение мембраны и клеточных стенок, окрашивающих нитеозные грибы в начале тысячелетия, в буквальном смысле произвело революцию в том, как мы смотрим на грибы. Calcofluor белый может вызвать раздражение глаз и классифицируется cancerigen. Конго красный является раковым и тератогенным, поэтому, пожалуйста, носить глаз и кожи защиты при обработке этих красителей.
