Этот метод может ответить на ключевой вопрос о роли врожденной иммунной системы в инфекции Clostridium, как, если и как макрофаги признают или фагоцитозы этого патогена. Основным преимуществом этого метода является то, что он может быть применен к различным анаэробным бактериям, что время заражения можно манипулировать, и что пероральная администрация представляет собой нормальную инфекцию человека гораздо ближе. После культивирования перенесите один миллилитр культуры в спектрофотометр кюветт и измерьте OD600.
Перенесите необходимое количество в свежую 1,5-миллилитровую трубку, чтобы достичь конечного ОД от одного до 1,2 в один миллилитр конечного объема. Вымойте один раз с одним миллилитром 1X PBS, и центрифуга в 5000 раз г в течение трех минут при комнатной температуре. Resuspend в один миллилитр 1X PBS.
Добавьте три микролитров рабочего раствора подготовленного флуоресцентного красителя в одноми миллилитровую бактериальную суспензию. Инкубировать образец в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. После этого, мыть окрашенные Clostridioides difficile один раз с 1X PBS, чтобы удалить остаточный краситель, и повторно в один миллилитр 1X PBS для достижения OD600 из 1,0.
Во-первых, поместите падение на 0,8% низкоплавления агарозы на личинки зебры в чашке Петри, чтобы покрыть. Аккуратно отрегулируйте личинки в боковом положении. Поместите чашку Петри на лед на 30-60 секунд, чтобы низкоплавильная агароза затвердела.
Добавьте 30% среды Danieau, содержащей 0,02%до 0,04%tricaine для покрытия агарозы. Чтобы подготовить инъекционный раствор, добавьте один микролитер 0,5%фенол красный в растворе PBS в девять микролитров окрашенных красителей Clostridioides difficile inoculum. Загрузите откалиброванную микроинъекцию иглы с помощью инъекционного раствора с помощью микрозагрузчика.
Намонтировать загруженную иглу в микроманипулятор и распоставить под стерео микроскопом. Отрегулируйте давление инъекций между 600 и 900 гектопаскалями. Установите время впрыска до 0,1-0,3 секунды, чтобы получить от 0,5 до 1,0 нанолитров.
Установите иглу в микроманипулятор под примерно углом 45 градусов, указывая на встроенные личинки. Поместите кончик иглы над желудочно-кишечным трактом, близко к урогенитальной поре. Прокалывайте агарозу, затем мышцы кончиком иглы.
Затем вставьте его в кишечный люмен, и ввести от 0,5 до 1,0 нанолитров Clostridioides difficile. Используйте флуоресцентный микроскоп для мониторинга инъекционных личинок и используйте гибкий наконечник Microloader, чтобы подобрать правильно введенные личинки для конфокальных изображений. В 1,5%agarose пластины с канавками, место падение 0,8% низкоплавления агарозы на личинки зебры, чтобы покрыть.
Аккуратно отрегулируйте личинки с головами, обращенные вертикально под углом 45 градусов в паз и хвосты к стене паза. Аккуратно оперировать иглой через агарозу, затем в рот личинок зебры, через пищевод. Как только кончик иглы находится внутри передней кишечной лампы, нажмите педаль впрыска, чтобы освободить 0,5 к одному нанолитров культуры бактерий.
Заполните люмен кишечника. Не позволяйте ему переполнения из пищевода или клоака. Аккуратно вывяйте иглу из рта зебры.
После gavage, спасти инфицированных личинок зебры из агарозы с гибкой микрозагрузчик отзыв, сначала резки агарозы прочь, а затем путем подъема личинок. Перенесите эти личинки в стерильную 30%среду Данио и промойте дважды. После обезболировки личинок зебры добавьте от 200 до 300 микролитров 1%низкоплавильющей агарозы, чтобы покрыть обезболещенные личинки.
Поместите зараженную область личинок на стеклянную горку как можно ближе. Пусть агароза затвердеет на льду в течение 30-60 секунд. Погрузите агарозу в среду 30%Danieau, содержащую от 0,02%до 0,04%tricaine.
Приступайте к изображению личинок с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. После усыпания инфицированных личинок зебры, вставьте иглу в спинной ствол личинок зебры близко к голове, чтобы обездвижить зебру. Удалите голову за жабры с ланцетом.
Вставьте вторую иглу в середину спинного ствола. Вставьте третью иглу в брюшную полость зебры и вытащите кишечник из полости тела. Используйте микроинъекцию иглы для передачи от 10 до 15 кишечника в 1,5-миллилитровую трубку, содержащую 200 микролитров стерильных 1X PBS.
Гомогенизировать кишечник с пестиком, чтобы нарушить ткани и подготовить гомогенаты. Убедитесь, что пестик достигает нижней части трубки, чтобы нарушить все кишечника полностью. В гомогенаты, добавить Clostridioides difficile воспитания среды, содержащей D-циклосерин и cefoxitin, с или без таурохолата, и инкубировать в анаэробной камере.
В этом исследовании, как нейтрофилов и макрофагов достичь инфекции сайтов. Пример активированного макрофаг фагоцита двух бактерий показывает очистку от фагоцитоза и пищеварения помечены Clostridioides difficile. Микрогавейдж для доставки флуоресценции помечены Clostridioides difficile в кишечный люмен макрофага и нейтрофила репортер линий на пять дней после оплодотворения имитирует естественный путь Clostridioides диффицил инфекции.
Однако нейтрофилов и макрофагов не было очевидной миграции в желудочно-кишечный тракт в течение 12 часов после микрогавейга. В то же время, флуоресценция помечены Clostridioides difficile исчез примерно через пять часов после микрогавейга. Образцы кишечника 24 часа после заражения были вскрыты и показали рост бактерий.
В контрольной группе бактерий не выросло. В более поздние моменты времени, инкубированные образцы только вырос в среде, содержащей TCA, предполагая, что общее Clostridioides difficile в кишечнике сформировали споры. 16S rDNA PCR определил выращенную бактерию как Clostridioides difficile, которые производят специфические ПЦР ампликоны предсказуемого размера около 800 базовых пар.
Бактерии культур, выращенных на пластине CHROMID появились в качестве типичных черных колоний, которые далее указали, что бактерии из кишечника зебры были Clostridioides difficile. Работа с анаэробными бактериями требует, чтобы аэробные шаги были короткими, потому что это влияет на биологию бактерий, конечно. Врожденные иммунные клетки у зебры можно манипулировать.
Например, они могут расшифровать механизм врожденной иммунной реакции клеток на инфекцию. Наш метод показал, что зебрафиш может быть инструментом для изучения анаэробного патогена из кишечника человека. Работа с мультистойкими патогенами требует принятия надлежащих мер безопасности.
