Этот протокол имеет важное значение, потому что он использует метод визуализации без пятен вместо красителя на основе визуализации на посмертной ткани человеческого мозга, которая помогает сохранить целостность РНК. Сохранение РНК является большим преимуществом в этом протоколе, так как полезно не только в посмертной ткани мозга человека, но и в других типах тканей, с высокой активностью RNase. Для начала удалите ткань из морозильной камеры и поместите ее на сухой лед для транспортировки в криостат.
Поместите чистые щетки, патрон и ткань в криостат, по крайней мере 20 минут, чтобы позволить им достичь оптимальной температуры. Для криостатов с двойными камерами и температурами, удерживая образцы, установите температуру объекта до минус 16 градусов по Цельсию, а температуру камеры до минус 18 градусов по Цельсию. Установите толщину секции криостата до 14 микрометров, а толщину отделки до 30 микрометров.
Затем очистите сцену смесью RNase без обеззараживания и 70%этанола, чтобы предотвратить замерзание. Получить новый, одноразовый криостат лезвие и очистить его с RNase обеззараживателя. Поместите очищенное лезвие в держатель лезвия на сцене.
Затем очистите анти-ролл пластины с rNase обеззараживателя. Прикрепите очищенную пластину к сцене и подождите не менее 20 минут, пока лезвие и анти-ролл пластины спуститься к температуре криостата. Во-первых, вырезать небольшой кусочек ткани для секции, убедившись, что раздел составляет примерно 95%мозжечковой коры.
Верните оставшуюся ткань либо в сухой лед, либо в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Затем начните медленно добавлять OCT поверх патрона медленным круговым движением. Создайте слои внебиржевого до тех пор, пока есть крепление высотой около трех миллиметров, покрывающее патрон.
Когда OCT частично заморожены, но все еще имеет некоторую жидкость в центре, поместите ткани на вершине крепления. Пусть ткань сидеть на верхней части OCT в течение одной-двух минут, пока она полностью заморожена. Затем перенесите патрон с замороженным OCT и ткани в криостат резки руку.
Отрегулируйте ткань так, чтобы она промыта режущей лезвием и позволила ткани сидеть в режущей руке в течение 20 минут, чтобы приспособиться к новой температуре. Наиболее важным шагом является позволяет ткани акклиматизироваться в криостат резки руку до тех пор, как это необходимо. Если ткани клочья, purkinje визуализации клеток будет очень трудно.
Я рекомендую использовать меньшие, тонкие кусочки ткани, чтобы позволить ткани акклиматизироваться быстрее. После этого медленно переместите ткань ближе к лезвию. Как только ткань достигла лезвия, начните процесс обрезки.
Обрезать ткани два-три раза, пока слои коры видны. Далее поместите и выровнять анти-ролл пластины чуть выше криостата лезвие. Вырезать четыре-шесть разделов, которые 14 микрометров толщиной, что правильно сократить разделы будут плоскими под анти-ролл пластины.
Выровнять разрез разделы горизонтально через стадию криостата. Угол слайда, чтобы забрать все части ткани одновременно. Сразу же после раздела ткани, поместите слайд в держатель слайда с 70% этанола на льду в течение двух минут.
Перенесите слайд на держатель слайда с 95%этанолом на льду в течение 45 секунд. Затем поместите слайд в держатель слайда со 100%-ти этанолом при комнатной температуре в течение двух минут. Опустите слайд три раза в держатель слайда, содержащий ксилен номер один при комнатной температуре.
Затем поместите слайд в держатель слайда с ксиленом два при комнатной температуре в течение пяти минут. Стенд слайды в чистом капоте дыма и дайте им высохнуть воздух, по крайней мере 30 минут. При хранении слайдов поместите каждый из них в отдельную 50-миллилитровую трубку и поместите трубки в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов по Цельсию на срок до семи дней.
Во-первых, используйте обеззараживатель RNase для очистки стадии микроскопа и руки коллекции крышки. С руками в перчатках поместите слайд на микроскоп и 500 микролитер непрозрачной крышкой в руке коллекции. При низком увеличении, выровнять непрозрачный колпачок над мозжечковой ткани, заверив, что крышка охватывает всю область, которая визуализирована в глазу кусок.
Используйте пять раз до 10 раз объективной визуализации мозжечковых слоев. Поместите курсор над секцией, где пересекаются молекулярный слой и слой гранулированных клеток. Перейти к 40 раз увеличение и визуализировать клетки purkinje.
Затем начните захватывать их. Чтобы начать сбор РНК после микродиссекции, добавьте 50 микролитров буфера клеточного лиза к непрозрачной крышке с крышкой вверх. Аккуратно закройте трубку над крышкой и приступайте к сбору, как указано в текстовом протоколе.
В этом протоколе, свежие, замороженные, посмертные, ткани человеческого мозга готовится для УФ-лазерного захвата микродиссекции. После секционирования криостата в отведенное время рисования, клеточные слои мозжечка легко видны с пятью и 10 раз объективными линзами. Как видно здесь, надлежащее инкубации ксилена вызывает ткани, чтобы стать темнее и лучше очерчивает клеточных слоев, чем этанол в одиночку.
При резке на микроскоп захвата лазера, 40 раз объектив объектива требуется для обеспечения захвата только клетки purkinje, а не окружающие ткани. Как видно здесь, надлежащее инкубации в ксилен производит высокое качество морфологически нетронутыми изображения по сравнению с этанолом фиксации в одиночку. Способность скольжения крышки непрозрачной крышки после этого испытана пока другие протоколы используют жидкостн-заполненную крышку, эти крышки могут уменьшить визуализацию ткани и причинить приводящ к изображению быть гранулированным и радужным под микроскопом.
Тем не менее, визуализация через непрозрачный колпачок приводит к гладкой ткани внешний вид, который мягче и острее по форме. Репрезентативные изображения вырезанных клеток пуркинье при низкой мощности и при высокой мощности показывают точное удаление только тела клетки пуркинье. После этого, высокое качество Rnase получается для последующего секвенирования РНК.
Шесть репрезентативных образцов прошли экстракции РНК и были повторно использованы в 14 микролитров рнк свободной воды и все шесть образцов производится высокое качество РНК с РНК целостности номера равны или больше, чем восемь. Самое главное помнить, что качество тканей это все. Даже резки и слайд размещения сделает перерыв или этот протокол.
После этой процедуры, любой метод, который исследует РНК или ДНК может быть выполнена, в частности, мы зонд нашей РНК для дифференциальной экспрессии генов, но другие вопросы, касающиеся регуляции генов также могут быть исследованы. Этот метод может быть применен к любому типу тканей, который имеет конкретные очерченные морфологии, которая не требует использования антигена или красителя конкретных реагентов для идентификации клеток, представляющих интерес. Мы надеемся, что этот метод поможет нам понять генетику основных тремор и других заболеваний, которые имеют тремор фенотипа.
Наиболее опасным химическим веществом, используемым в этом протоколе, является ксилен. Она должна быть обработана должным образом в дым капот, утилизировать должным образом, и слайды должны быть разрешены для адекватного высыхания до тех пор, пока используется в открытом пространстве. Кроме того, при работе с образцами человека следует использовать биоопасное управление отходами и безопасность.
