Способность приобретать большие объемы данных в ходе экспериментов по визуализации кальция значительно улучшилась, особенно в ходе экспериментов по визуализации тканей. Наши протоколы описывают соответствующие методы анализа для количественной оценки и описания этих наборов данных. Наши протоколы генерируют целый ряд пространственных, временных и интенсивности значений, которые присущи сигнализации кальция в целых тканях, и это может быть потеряно в более элементарном анализе.
За час до передачи изображения тонкой кишки, собранной из мыши с интерстициальными клетками Cajal или ICC, которые специально выражают генетически закодированный индикатор кальция на стадию вращающегося конфокального микроскопа диска. И непрерывно пронизывают ткани с 37 градусов по Цельсию Кребс-Рингер бикарбонат или KRB раствор. С помощью увеличения от 60 до 100 X найдите stellate-образное миентическое сплетение ICC или ICC-MY между круговыми и продольными гладкими мышечными слоями тонкой кишки.
Затем найдите шпиндель-образное глубокое мышечное сплетение ICC или ICC-DMP в одной плоскости между круглым гладким мышечным слоем и подмукозаным сплетением и сохраните фильмы в качестве стопки изображений TIFF. Для создания spatiotemporal карты или STMs активности кальция ICC-DMP открыть стек изображения в ImageJ, и нажмите Изображение, Тип и 32-битный изменить качество изображения. Чтобы создать сканирование строки, нажмите правой кнопкой мыши на инструмент выбора строки и выберите сегментированную линию.
Используя одиночные левые щелчки, провести линию вдоль среднего доступа отдельного ICC-DMP, дважды нажав, когда вся ячейка была изложена. Выберите изображение, стеки и reslice. Появится всплывающее окно.
Выберите Поверните на 90 градусов, чтобы сориентировать сканирование линии слева направо, чтобы его можно было откалибровать и прочитать со временем на х-оси с пространством на оси и нажмите OK. Появится spatiotemporal карта. Чтобы точно измерить амплитуду сигналов кальция с карты, выберите прямоугольный выбор и нарисуйте область интереса вокруг области в STM, которая отображает наиболее равномерной и наименее интенсивной области флуоресценции. Нажмите Анализ и Гистограмма, чтобы получить среднее значение интенсивности в выбранной области интереса и нажмите Редактировать, Выбор, Выберите все, чтобы выбрать весь STM.
Далее нажмите Process, Math and Divide и введите среднее значение интенсивности с выбранной областью STM, представляющим интерес для всплывающего окна. STM почернеет. Исправь это, нажав изображение, настроить, яркость / контрастность, и авто во всплывающем окне.
Сканирование линии теперь будет откалиброваться для амплитуды с интенсивностью флуоресценции, выраженной как флуоресценция, разделенная нулевой флуоресценцией. STM будет отображать количество кадров в стеке TIFF на оси x и количество пикселей, представляющих длину ячейки на оси y. Для количественной оценки временных и пространственных данных из сигналов кальция нажмите Изображение и Свойства и введите соответствующие значения, чтобы полностью откалибровать STM для пространства и времени во всплывающем окне.
Чтобы проанализировать отдельные события кальция нажмите Прямая линия и нажмите и перетащите на STM, чтобы нарисовать прямую горизонтальную линию через центр кальция событие параллельно x-оси. Затем нажмите Анализ и Участок профиля. Появится коробка, показывающая профиль сюжета события кальция.
Для анализа данных сигнализации кальция ICC-MY на основе частиц откройте файл фильма в Volumetry и нажмите правой кнопкой мыши, чтобы выбрать STK Filter, Differentiate. Нажмите правой кнопкой мыши еще раз, чтобы ввести значение, чтобы дифференцировать. Нажмите Введите и левым щелчком мыши, чтобы инициировать дифференциацию.
Чтобы создать частицы, используйте среднюю кнопку мыши, чтобы прокрутить фильм, чтобы выбрать от 20 до 40 раздел кадра, который включает в себя период тихие, а затем появление переходного кластера кальция и от 20 до 40 кадров, которые следуют сразу после кластера. Когда все кадры были выбраны правой кнопкой мыши в окне фильма, чтобы получить доступ к информации частиц STK OPS Ramp DS и нажмите, чтобы запустить процедуру анализа частиц, которая постепенно увеличивает порог от максимальной до минимальной интенсивности. Чтобы обеспечить успешный анализ частиц, убедитесь, что вы включаете столько до кальция переходных кластера не-активности, и столько пост-кальция переходных кластера не активности, как вы можете.
Это поможет повысить соотношение сигнала к шуму. Анализ будет отображаться графически в окне участка как участок шума и в окне следов, как три цветовых следа с зеленым следом, представляющим количество частиц, красный след, представляющий средний размер частицы, и синий след, представляющий абсолютный порог интенсивности. Для того чтобы гистограмма балансирует график шума частицы нажимает H на клавиатуре.
Затем нажмите на правый ключ кронштейна, чтобы цикл через цветовые схемы, пока фон белый со следами цвета на вершине. Нажмите F на клавиатуре один раз, чтобы воспитывать измерительный инструмент. Затем нажмите F во второй раз, чтобы отметить одну вертикальную линию в строке прокрутки окна следов на участке на перекрестке, где цветные участки начинают смещаться в правую сторону.
В окне следов используйте среднюю кнопку мыши для прокрутки от точки перегиба красного следа до отмеченной белой вертикальной линии. После записи отображается Y среднем, нажмите среднюю кнопку мыши снова внутри окна следов, чтобы отбирать синий след. В окне фильма нажмите C, чтобы принести цветовое колесо, и D, чтобы настроить порог.
Действительные частицы теперь будут показаны красным цветом, а те, которые насыщаются, будут белыми. Используйте левую кнопку мыши, чтобы прокрутить, пока белые области не будут удалены и использовать среднюю кнопку мыши, чтобы настроить желтое числовое значение в колесе цвета к среднему значению Y, чтобы назначить все красным цветом в качестве активной переходной частицы кальция в определяемой пороговой точке. Чтобы сохранить данные в качестве файла частиц на основе координат, нажмите правой кнопкой мыши, чтобы получить доступ к STK 3D, сохраните частицу ноль и левое нажатие, чтобы сохранить файл.
Для создания тепловых карт активности частиц откройте сохраненный файл частиц и нажмите правой кнопкой мыши в окне фильма, чтобы получить доступ к частицам STKops, флагу StatMap и ввести задания флага для анализа. Нажмите, чтобы применить анализ и тепловую карту, показывающую общие частицы по всей длине записи с различными цветами, представляющими процентное явление на протяжении всей записи. Нажмите правой кнопкой мыши, чтобы сохранить тепловую карту в качестве файла TIFF.
Затем нажмите правой кнопкой мыши в окне фильма, чтобы получить доступ к измерению частиц, статистике частиц STK равно, и введите назначение флага для анализа. В окне трассировки будет создан ряд следов. Анализ STM обеспечивает возможность мониторинга и записи пространственных характеристик сигнализации кальция, таких как пространственное распространение и скорость распространения.
Эта информация может быть собрана, чтобы обеспечить довольно полное представление кальция сигнализации поведения в клетках в их родной среде. С помощью анализа частиц количественная информация о сигнализации кальция может быть рассчитана путем измерения площади частицы и количества частиц, которые вместе могут быть использованы для определения пространственных диапазонов активации сигнала кальция в пределах определенного поля зрения. Анализ частиц также позволяет провести углубленную количественную оценку субклеточной сигнализации кальция путем изучения местоположения и вероятности стрельбы по местам обжига кальция.
Распределяя частицы на различные флаги в зависимости от их временных характеристик, инициируя частицы могут быть точно отображены. И огромное количество твердых данных, полученных о количестве сайтов посвящения, размер сайта в пикселях и микрометрах, вероятность каждого места инициации стрельбы один или несколько раз во время каждого переходного кластера кальция, и процент огневых площадок, которые стреляют во время каждого переходного цикла кластера кальция могут быть получены. Последовательность является ключом к успеху в этом протоколе.
Все наборы данных и все фильмы должны рассматриваться точно так же, чтобы обеспечить надежные, повторяемые результаты. Это особенно верно при работе с файлами частиц. Наши протоколы позволяют получить глубокую характеристику сигнализации кальция на месте, а ряд статистических методов при надлежащем использовании может оценить различия между диапазоном пространственных и временных параметров.
Эти методы анализа в нашем протоколе позволили исследователям задать и ответить на ранее нерешенные вопросы, связанные с кишечным темпоотделом и иннервации кишечника, а также нейронного контроля нижних мочевыводящих путей.
